肝癌早筛新宠ctDNA甲基化，筑起抗癌防线！

我国是肝癌大国，肝癌可谓我国的“国病“。但是目前肝癌的诊疗仍然面临着重大问题：早期诊断困难、复发转移率高、放化疗耐受和缺少有效治疗靶点等。

我们也都知道，对于任何癌种，早筛始终是抗击癌症的关键性一步。

肝癌早期诊断的常规监测筛查指标主要包括甲胎蛋白（AFP）和肝脏超声检查（US）。综合国内外的报道和临床实际，AFP诊断敏感性在60%左右，漏诊率为40%，特异性在80%左右，误诊率为20%，也是美国肝病研究学会（AASLD）指南不再将AFP作为筛查指标的一个重要原因。而超声检查对于大于20mm的结节，诊断符合率尚为84%，但对于肝内5-20mm的结节，超声的敏感性就只有33%。

因此，迫切需要研发新的肝癌早筛生物标记物。

早筛新宠ctDNA甲基化

通过液体活检开发癌症早筛的技术最早在美国兴起，包括ctDNA、CTC和外泌体。相比传统的组织切片检测，其侵入性和副作用都要小得多，因此为癌症早筛带来了新的希望。

其中ctDNA是患者血液中游离的来自肿瘤的DNA，属于高敏感性、高特异性的肿瘤标志物。其相当于肿瘤细胞释放到血液中的“身份指纹”，因其携带有与原发肿瘤组织相一致的甲基化改变，因此理论上可以利用ctDNA对肝癌进行诊断，通过提取游离肿瘤DNA并进行甲基化测序，分析甲基化模式来判断肿瘤的部位，从而很好的判断肿瘤的组织来源。

它与突变不同，癌症的突变十分复杂，具有高度的个体化，而基因的甲基化改变相当于调控基因表达的“开关”，其稳定性和一致性非常好，是癌症早筛的理想手段。

专家们一致认为：检测这些循环DNA 片段可能比常规肝活检更加容易，同时也是更安全的一种方式，有望在肿瘤超早期发现，为医生赢得治愈肿瘤的时间。

突破性进展

去年，国际学术顶尖杂志《Nature Materials》发表了中山大学肿瘤防治中心主任徐瑞华教授与美国加州大学圣地亚哥分校张康教授联合团队历时5年完成的肝癌早期诊断研究成果。他们通过检测少量血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）特定位点甲基化水平，将肝癌早期诊断敏感性从60%提升至84.9%。该团队从40多万个候选位点中，分别寻找到10个早期诊断、疗效相关以及8个预后相关的位点，破获了肝癌的“身份指纹”，并在接近2000例肝癌患者和正常人群验证了其准确性的肝癌早诊模型，是目前已知最大样本规模ctDNA甲基化癌症早诊研究。而且还利用这8个预后相关位点的甲基化水平准确地预测不同患者的生存和预后。这些都非常有利于指导医生进行更为个体化的精准治疗。

整体看来，这项技术的优点可概括为：1、无创性，仅凭少量外周血标本即可完成检测，不会引起肝癌播散;2、实时性，可动态反应肿瘤细胞的遗传改变和演变进程，避免反复有创的组织活检；3、全面性，反映的是体内肿瘤细胞的分子遗传信息的全貌，避免了瘤内异质性对组织活检结果的影响;4、准确性，其所携带的分子遗传学信息来自原发肿瘤，具有高度敏感性和特异性。

对于肝癌的高危人群预警和术后监测，ctDNA甲基化的液体活检无疑是十分必要的。而且除了肝癌之外，ctDNA甲基化标志物在结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等其他严重威胁人民健康的常见癌症中也已应用。

仍需克服的短板

关于ctDNA甲基化的检测，传统的检测方法是围绕少量目标候选基因的检测，主要是基于PCR扩增的甲基化敏感限制性酶切，亚硫酸氢盐测序等方法。随着高通量测序技术的发展，微量的ctDNA中进行全基因组重亚硫酸盐测序也逐渐成为可能，如新的ctDNA高通量甲基化测序技术（MCTA-Seq）对富含CGCGCGG的位点进行扩增，可以检测出cfDNA中成千上万超甲基化的CpG岛，只需7.5 pg的基因组DNA。

但是，ctDNA在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约20ng，并且混杂在更大量的正常游离DNA背景中，在这么微量的ctDNA中检测单个碱基的甲基化水平仍存在很多困难。此外，由于在很多正常人的血液中也有可能会发现非常微量的癌症相关基因DNA变化的痕迹，所以癌症早筛的技术一定要经过大规模的临床样本验证，尤其是早期肿瘤甚至肿瘤临床诊断前的样本的验证。否则，即使是再精确的技术，检测出来的信号也很难有效证明受检者是否确实有癌症存在。

此类因素都会限制这项技术在肝癌临床上的应用，今后随着甲基化检测技术研发和临床应用进展速度发展，如何将特异性的DNA甲基化标志物用于HCC早期诊断、分期、预后和治疗的临床检验试剂盒的研发将是重点，继而将相关试剂盒用于大规模肝癌早筛，其经济性、高特异性等必能够节约大量宝贵的医疗资源。

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推荐

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。作为一个比较理想的肿瘤早期诊断的生物标志物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。未来随着检测技术的发展和人类对甲基化研究的深入必将对人类健康产生深远的影响。

第二届现代临床分子诊断研讨会将开展“甲基化的技术进展和临床应用”分论坛，与参会人员共同探讨甲基化技术进展和临床应用。

（转化医学网360zhyx.com）