基因编辑新台阶,浙大韩峰课题组揭示一种提升CRSIPR系统精确度的新途径

2018年7月24日，浙江大学药学院韩峰课题组联合耶鲁大学在Cell Discovery上发表了题为“Programmable DNArepair with CRISPRa/i enhanced homology-directed repair efficiency with asingle Cas9”的文章。该研究试图提供了一种有效，灵活且可能更安全的途径，即使用CRISPRa /i进行可编程DNA修复，进而提高单个Cas9同源定向修复效率。这种方法可以增强基因组修饰的精确度，这可能会对人类基因编辑和治疗产生重大影响。

CRISPR系统已被证明是哺乳动物物种特异性基因组工程的通用工具。在基因编辑过程中， RNA引导核酸酶引入DNA双链断裂（DSB），其中非同源DNA末端连接（NHEJ）支配DNA修复途径，限制同源定向修复（HDR）的效率，是精确基因打靶所必需的替代途径。目前研究者已经开发了多种方法来增强HDR，包括化学化合物或RNA干扰介导的NHEJ因子抑制，HDR酶的小分子活化或CRISPR复合物的细胞周期定时传递。然而，这些方法面临多重挑战，但却具有一定影响。该研究开发了一种新方法，使用CRISPR激活和干扰（CRISPRa / i）对NHEJ和HDR途径进行编辑，以显着提高CRISPR介导的基因编辑的HDR效率。 NHEJ和HDR途径组分的操作，例如CtIP，CDK1，KU70，KU80和LIG4，由催化死亡的指导RNA（dgRNA）介导，因此仅依赖于单个催化活性的Cas9来执行CRISPRa / i和精确的基因编辑。虽然大多数DNA修复因子或其组合的重新编辑测试增强了HDR效率，但在激活CDK1和抑制KU80中效果最好，其中HDR速率更是增加到一个数量级。强力霉素诱导的基于dgRNA的CRISPRa / i编辑DNA修复酶，以及病毒包装增强了HDR在哺乳动物细胞中更广泛的适用性。该研究提供了一种有效，灵活且可能更安全的途径来增强精确的基因组修饰，这可能人类基因编辑和治疗产生深远影响。

生物体进化出多种机制来维持基因组完整性。由于细胞基因组不断受到环境破坏，因此存在多种DNA损伤修复途径以保护基因组免受有害或潜在的灾难性改变。 DNA双链断裂（DSB）修复途径在真核生物（包括哺乳动物物种）之间高度保守。非同源DNA末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）是两种主要的DNA修复途径，可以协同作用或拮抗作用。 HDR是使用模板DNA的途径，例如完整的姐妹染色体拷贝或外源供体修复DSBs7，因此可以稳健地产生完美的修复。然而，HDR效率取决于物种，细胞类型和细胞周期阶段。在哺乳动物细胞中，NHEJ被认为是修复DNA的主要途径，而HDR在酿酒酵母中更为常见。 NHEJ是一个不完美的过程，通常会导致断裂位点每端的几个核苷酸的获得或损失。这种特征可导致随后的有害遗传改变，导致细胞功能障碍，癌症或衰老。 DNA修复酶KU70，KU80和连接酶IV（LIG4）在NHEJ介导的DNA修复中发挥核心作用，其中KU70和KU80蛋白稳定DNA末端并使它们物理接近以促进LIG47进行的末端连接。另一方面，诸如BRCA1 / 2，RAD50，RAD51和各种细胞周期调节因子的蛋白质也可以直接参与同源定向修复（HDR）。

II型细菌适应性免疫系统聚集有规律的间隔回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9），是一种强大的基因组编辑工具。 Cas9 - 单指导RNA（sgRNA）复合物诱导位点特异性DSB，可通过两种主要的DNA修复途径NHEJ和HDR修复。 NHEJ容易出错的修复经常引入不可预测的移码插入和缺失（indel），导致靶基因功能丧失。相比之下，HDR可以生成完美的DNA修复或由供体模板指导的精确基因组修饰。与哺乳动物细胞中的NHEJ相比，HDR效率显着降低，并且最常限于细胞周期的S / G2期。由于HDR在调节精确遗传修饰中的重要性，研究人员已经进行了大量努力来改变DNA修复途径的平衡。然而，由于DNA修复途径的复杂性，增强HDR的可用工具仍局限于少数选择，效果相对较差。迄今为止，直接增加人类发展报告路径本身并未取得多大成功。因此，使用简单的遗传工具操纵HDR和NHEJ可以实现或加强各种基因组编辑应用。最近，14-nt或15-nt指导RNA已被证明具有催化活性，但仍保持靶位点结合能力。这些催化死亡的指导RNA（dgRNA）可用于使用催化活性的Cas9调节基因表达进而可以将活性Cas9核酸酶重新利用以同时进行基因组编辑并使用相同细胞中的两种类型的gRNA调节基因转录。因此，可以假设使用单个活性Cas9来部署dgRNA以及相关的CRISPR激活（CRISPRa）和干扰（CRISPRi）模块来实现HDR增强。

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https://www.nature.com/articles/s41421-018-0049-7（转化医学网360zhyx.com）