人类胚胎基因编辑—Nature的质疑与回应!

2017年8月，俄勒冈国家灵长类动物研究中心Shoukhrat Mitalipov等利用CRISPR-Cas9 基因组编辑技术修正了未被植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏疾病有关的变异，并进一步证实编辑人类生殖细胞系（卵子、精子或早期胚胎）的DNA是安全有效的。该文章发表后不久，六位科学家联名在预印本杂志bioRxiv上发表文章质疑Nature文中的一个关于“细胞主要利用自身序列进行修复”的结论，该质疑论文发表后引起了媒体的广泛关注。事情过去了差不多正好一年，近日Nature以Brief Communications的形式一次性发表了3篇相关文章，其中两篇文章主要是是质疑此前Nature中的结论，而另一篇则是来自Mitalipov组的文章是针对质疑做出的回应。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的抵御入侵病毒或者外源DNA的一种获得性免疫防御机制，通过该系统细菌实现自我保护。2013年初，两个实验组将CRISPR/Cas9技术成功的在小鼠以及人细胞内实现精确的基因编辑。随后引发了CRISPR/Cas9的井喷式发展，在基因编辑领域表现出来的巨大潜力和广阔的应用前景，是以往任何一项基因编辑技术无法比拟的。

2017年，Nature发表了美国科学家Shoukhrat Mitalipov等成功利用CRISPR/Cas9技术在人类早期病原性胚胎中修复导致先天性肥厚型心肌病基因突变的研究成果。这一工作不仅表现了CRISPR/Cas9技术在生殖细胞基因编辑治疗遗传学疾病的巨大潜能，同时也提出了iPS细胞与人类胚胎对Cas9 切割的双链DNA断裂(DSB)可能存在不同的修复机制。在携带杂合突变iPSC细胞中，DSB主要利用外源ssDNA为模板进行同源重组修复（HDR）。然而在人类胚胎中，受精18小时后原核期注射CRISPR/Cas9的胚胎组所有的突变allele都利用内源的WT allele作为同源重组模板，仅在通过与精子同时注射到MII卵母细胞的胚胎组中，存在一个卵裂球选择了外源ssDNA作为模板进行修复。截然不同的结果说明早期胚胎中有着较iPSC细胞更为精细的HDR修复机制，在选择DSB修复模板中可能存在着更为精细的模板识别校对机制。

这一工作引发了不仅全球社会人士以及科学家的热点关注，也带来了包括哥伦比亚大学Dieter Egli， 发育生物学家Maria Jasin 以及 George Church在内的一些干细胞科学家的质疑（下图）。争论的焦点在于Egli等认为受精后，卵子和精子的基因组分别位于受精卵的两端，很难跨越巨大的距离发生内源性的HDR。他们认为精子中的突变并没有真正的修复，而是CRISPR/Cas9造成的大片段丢失大于PCR检测的534bp, 而导致PCR过程中只检测到WT 母源allele, 并没有真正检测到突变精子来源的父源allele, 同时也有可能是卵子中并没有精子参与，而是孤雌激活形成的胚胎。

同样，来自澳大利亚阿德莱德大学的Paul Thomas等发现在小鼠CRISPR/Cas9编辑胚胎中存在大片段丢失（下图），他们因此认为是人胚胎中可能也存在突变位点大片段丢失，而导致未检测到mutant allele，错误的以为发生了HDR修复。

同时，Mitalipov研究组也在Nature上针对这些疑问进行了后续实验回应相关质疑（下图）。他们通过对突变修复的多个胚胎的不同卵裂球进行覆盖突变位点493bp到10160bp不同长度的8组大片段PCR来回应不存在大片段缺失。通过对修复的单个卵裂球的SNP位点分析发现，其中部分修复卵裂球多个SNP位点均失去了杂合性，且转换成纯合的母源nucleotides。 而部分修复的卵裂球仅离突变位点距离较近的SNP位点转换成了纯合的母源nucleotides，距离较远的SNP位点仍保留了分别来自卵子和精子的不同的nucleotides。 这一结果不仅说明了父源基因的存在排除孤雌激活形成的胚胎，同时也印证了突变精子利用同源的WT母源allele 作为模板进行HDR修复。

由此看来，内源性的HDR在CRISPR/Cas9介导的人类胚胎修复中起到了主导性作用，存在着较细胞更为精密修复的模板识别校对机制。这与中山大学黄军就研究员在对人类三原核受精卵中的研究结果也是一致的。其实早在2013年，中科院生化所李劲松研究员在利用CRISPR/Cas9治疗小鼠白内障疾病中就已经发现了小鼠胚胎可以利用内源的WT allele作为模板进行修复，加入外源DNA模板，并不能显著提高HDR修复效率。利用母源WT allele为模板修复的小鼠，不仅自身白内障疾病得到修复，并且可以稳定遗传给下一代健康的基因型和表型。但与人类胚胎不同的是在存在外源DNA模板的情况下，小鼠胚胎既可以选择外源DNA作为模板也可用内源WT allele.这也可能暗示着胚胎有较细胞更为精密的修复机制，而人类胚胎较小鼠胚胎又有着更加严谨的模板识别校对。

值得一提的是，今年年初，来自美国麻省理工的冯国平教授在线发表在biorxiv上对小鼠胚胎利用CRISPR/Cas9进行小鼠胚胎knock in 的研究中获得了高效率的纯合knock in 小鼠 , 并且存在多个胚胎的两个allele发现同样的非同源末端接合（NHEJ）修饰（下图）。NHEJ 会造成DSB断裂处碱基的随机丢失或者插入，多个胚胎纯合NHEJ的发生更可能是来自内源性的HDR 而不是随机的碱基修饰，其中一条allele利用已经发生NHEJ的allele作为模板，进行HDR修复。这一工作进一步肯定了HDR在早期小鼠胚胎的DSB修复中起到主导作用。

我们知道在受精卵形成过程中，精子经过染色质凝聚形成雄原核，随着卵母细胞完成第二次减数分裂，雄原核增大，并促使雌雄原核朝彼此的方向迁移，在迁移过程中完成各自DNA的复制，雌雄原核会合后，核膜崩解，雌雄原核核物质融合成合子。而在这个之前，父源DNA和母源DNA始终都是分开的，内源性HDR是如何发生的呢？CRSIRP/Cas9 介导的精子基因组上DSB会招募母源WT 染色体靠近还是CRSIRP/Cas9 介导的精子基因组上DSB会一直保留到雌雄原核融合以后才进行HDR修复？

我们并不完全了解人胚胎细胞中的最初阶段的生物机制，仍然需要更多的工作去研究不同的遗传疾病，不同的位点是否仍然存在同样的精确的修复机制，内源性HDR在雌雄原核分开的情况下是如何发生的，该论文研究结果对我们重新认识胚胎中的DNA修复机制有着重要的指导作用，对人类生殖遗传疾病治疗提供理论基础。（转化医学网360zhyx.com）