上次分不清几种基因修饰小鼠的人已经凉了

转基因小鼠

基因过表达研究好能手

转基因小鼠常用于基因的过表达。根据制备策略，分为随机转基因和定点转基因。随机转基因是将过表达载体注射到受精卵中，表达载体以随机方式插入基因组，首建鼠可能有多个位点插入，每个插入位点可能含有多个表达载体拷贝。这个特点导致有的转基因小鼠会发生表达沉默，因此需要对小鼠进行表达筛选，筛出正确表达的小鼠，进行建系才能用于后续实验。定点转基因是将基因表达载体插入到基因组特定位点上，如 Rosa26 位置，研究证明，这个位置不容易发生表达沉默，与随机转基因相比，优势是表达确定，但制备相对复杂，成本和周期增加。

图 1：转基因小鼠制备示意图

来源：Yale J Biol Med. 2011 Jun;84(2):117-124

基因敲除小鼠

费用逐渐降低

传统策略是通过同源重组的方式，用 Neo 基因替换或删除关键外显子来敲除基因，其周期长，费用高。TALEN，CRISPR 技术出现后，加速了基因敲除鼠的制作，而且降低了费用。CRISPR 切割 DNA 后，会引起的非同源末端修复（NHEJ），这种修复有一定的随机性，如果插入或删除非 3 的整数倍的核苷酸，会发生移码突变，造成基因敲除。移码突变的策略只需要单个 gRNA，但是后期检测一般需要测序，或者用分辨率更高的 Page 胶电泳，检测相对复杂，成本较高。

图 2：基因敲除小鼠制备示意图

这里有个需要注意的雷是某些敲除虽然发生了移码，但是蛋白水平检测发现，未能敲除目的基因。目前维通达采用双 gRNA 策略，删除关键外显子或整个目的基因，确保有效敲除目的基因，由于删除了一个大的片段，PCR 检测时，敲除小鼠很容易与野生型区别。

条件敲除小鼠

敲除致死的唯一模型

当目的基因敲除致死时，只能做条件敲除，常用 Cre-loxp 系统。那么如何操作呢？方法是在要敲除的区域两侧插入 loxp，得到的 floxed 小鼠与组织特异表达 Cre 的小鼠杂交，在 Cre 的作用下，两个 loxp 之间的区域被删除，可以实现在特异的组织敲除目的基因。条件敲除虽然也是敲除，但是制备这种小鼠实际是要定点插入 loxp 序列。

图 3：条件敲除小鼠制备示意图

点突变小鼠

可模拟单个碱基突变引起的疾病

某些疾病由单个碱基突变引起，通过突变小鼠的相应碱基可以模拟。CRISPR 打断 DNA 的同时，提供含有目的突变的单链修复模板，能够有效地建立点突变小鼠。影响点突变效率的主要因素是，该点突变附近有没有高效率切割 DNA 的 gRNA，如果有，是比较幸运的，如果没有，可以选取邻近的 gRNA，这可能造成二次切割，需要引入同义突变。在这里提醒大家，切割位点离突变位点越远，突变效率越低。

图 4：点突变小鼠制备示意图

基因敲入小鼠

制备基因人源化小鼠

CRISPR 打断 DNA 的同时，提供打靶载体，能够敲入外源 DNA。当需要敲入长度较小 DNA 片段时，CRISPR 能够有效地提高效率，如维通达制作的免疫检查点基因 PD1，CTLA4，Tim3，和 LAG3 的人源化小鼠，都是通过 CRISPR 技术，将小鼠的基因替换成人源的基因。对于 GFP 等各种标签的插入也可以用 CRISPR 来帮助制备。

图 5：基因敲入小鼠制备示意图

基于 ES 的传统打靶

EPS 细胞助力节省 3 个月研究时间

虽然 TALEN 和 CRISPR 出现后，大大提高了基因编辑的能力，但 CRISPR 等技术也并非全能。随着敲入片段长度的增加，大于 1kb 的片段时，CRISPR 等技术效率逐渐下降，而传统 ES 打靶周期长，费用高。由北京大学和维通达共同合作研发获得的 EPS 细胞（cell 期刊号：169（2）：243-257.e25.），具有超强的胚胎嵌合能力，一个 ES 细胞注入囊胚，就可以直接生出 ES 小鼠，越过嵌合鼠的步骤，节省三个月的时间，费用也大为节省。

图 6：基于 ES 的传统打靶小鼠制备示意图

（转化医学网360zhyx.com）