《转》访恒特基因CTO陈力博士：从“融”应变解决临床问题，布局转化精准造福患者

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随着恶性肿瘤发病率的不断增长，肿瘤精准诊疗的重要性更加彰显，其技术的发展受到广泛关注。恒特基因CTO陈力博士长期从事医学遗传学研究，对肿瘤相关精准治疗、基因检测技术等问题有着深刻的理解。在第三届现代临床分子诊断研讨会上，转化医学网采访到了陈力博士，陈博士为我们介绍了恒特基因的融合基因检测技术，并就高通量测序、液体活检、转化医学等生物医学领域热点问题进行了观点分享。

我们了解到，您的一篇文章刚刚被接收，能从这里谈起吗？文章内容可以剧透一下吗？

陈力博士：我们的文章被医学实验技术领域的核心期刊Clinical Chemistry接收， 该期刊在JCR（Journal Citation Reports）这一分区的30个期刊中排名第一，个人还是感觉比较欣慰的。这篇文章主要提供了一种称为PANO-Seq的新方法，在一个反应体系（或者说反应管）里同步对肿瘤组织样本的DNA和RNA两类核酸进行高通量测序检测，从而发现碱基突变和基因融合。文章也对这一方法的性能及样本要求做了探索，同时还发布了一项1000例肺癌队列研究的基因变异统计，该项工作由浙江省肿瘤医院牵头，国内多家单位共同合作完成。

有专家表示，基因融合现象在肿瘤病因及诊疗中非常重要，却是当前很多基因检测的痛点。您如何看待这一问题？基因融合检测目前的难点是什么？

陈力博士：在核酸水平上的变异我认为可以归纳为五类：碱基的点突变、碱基小片段的插入或缺失、DNA的拷贝数变异、RNA表达量的差异，还有基因融合。这五类变异在肿瘤中都有可能发生，因为一些突变比如说EGFR等常见的靶点在肺癌当中有很高的比例，中国人群中40%左右，所以传统上对碱基突变关注比较多，对基因融合关注较少。从肿瘤精准治疗史的时间维度来看，第一个靶点是血液肿瘤中的BCR-ABL融合靶点。在肺癌当中，除了第一个靶点EGFR是突变以外，第二个靶点ALK和第三个靶点ROS1都是基因融合。另外一个最近很火的靶点是NTRK1基因，也是融合变异，开创了FDA认可的一种新的临床试验入组方式，即广泛组织来源的篮式试验。变异的人群分布比例是不均匀的，突变确实要高于融合，但目前极具潜力的药物作用靶点明显偏向基因融合，可以看出融合基因的检测对患者的有效治疗是非常重要的。融合基因为什么难以检测呢？有两个原因。融合是两个基因之间的事件， 除了一个发生融合的靶基因外，还存在一个伙伴。该伙伴是基因组范围的，甚至是基因间的序列，或靶基因本身，事先往往不知道它会是什么。此外，靶基因和融合伙伴的拼接点分布在一个区域之内，也是未知的。两个“未知”叠加起来，融合基因检测难度可想而知。

可以简要介绍一下PANO-Seq技术吗？和现有技术相比优势在哪里？

陈力博士：NGS测序应用于肿瘤分子诊断，核心是文库构建技术。文库构建技术有很多，在国内比较常见的，一个是杂交捕获，一个是多重扩增。其实建库原理还有很多种，包括恒特原创的PANO-Seq（平行扩增数字优化测序）技术。从基础反应方式上讲，PANO-Seq比较接近多重扩增，也和公司创始人早期发明、ArcherDx公司获得授权、目前广泛用于RNA靶向测序的锚定多重PCR（anchored multiplex PCR）有共通的地方。此外我们还开发了两个特有的算法，SplitFusion和BinGo, 分别用于融合及突变的解析，将来也会公布。技术细节是我们技术人员关注的事情，在文章中也已全盘公开，但这个方案的设计重点是应用端的使用体验。PANO-Seq最大的优势，是可以进行融合和突变的单管检测。拿到一个临床肿瘤样本，刚开始并不知道它有什么类型的变异，这时候选择一个合适的NGS检测方法就显得尤为重要。我们想做的，就是在不预先猜测该样本会有什么类型变异的情况下，仅使用一个单线流程就把它检测出来。总结起来，这项技术的最大优势是在单个反应管里同时检测融合与突变，解决了未知的未知。

您一直强调单管检测，为什么？

陈力博士：近来行业内已认识到对DNA和RNA均进行检测的重要性。我们知道，DNA模板适用于突变检测，RNA模板适用于融合检测，所以最好两个核酸模板都利用上。分别或同时检测的方法早已存在，但缺陷在于人工、样本消耗、流程管理。比如纽约的纪念斯隆凯特琳癌症中心采用了两套体系，一种是自行开发的MSK-IMPACT，这是一个DNA大panel，针对突变的检测，也具有有限的融合检测能力。另一种是引进ArcherDx的MSK-Fusion，是基于锚定多重PCR原理内核的RNA模板融合检测方法，发现了很大比例被MSK-IMPACT漏检的融合病例。同时使用两套体系对大量临床样本进行NGS检测，这对于大多数单位来讲是难以想象的。也有变通的方法，比如联合检测试剂盒，也就是大致相同的反应原理和流程用一套试剂检测DNA，另一套检测RNA，中途可能有合并，但没有彻底解决问题。恒特PANO-Seq开发的初衷，是想“从头做到尾”——从样本的提取、建库、测序以及数据分析，都包含在一个单线流程中，中间不做分拆也不做合并，当做一个样本来处理，我们为其取名叫做“TNA”建库，即总核酸(Total Nucleic Acid)，可以概括为“211”：双模板平行扩增、单端锚定发现未知融合伙伴、单管检测。这样为操作流程提供了很多便利因素，比如可以很方便地在移液工作站上实现自动化，也不必在建库过程中设置各种质控采样点、调整点、暂停点，整体提升了检测质量。

您的研究方向是高通量测序在肿瘤诊疗中的应用，请您简单介绍一下该领域目前的发展情况。

陈力博士：关于测序，我是个“老人”了，大学时代就在手工做一代Sanger 测序，同位素标记，在暗房里冲胶片，是常态化操作。我接触NGS也很早，在09年-10年的样子，当时是做肿瘤细胞系突变的基因组定位。NGS作为一项实验技术，最初是为了解决组学测序的基础生物学需求出现和普及的。高通量测序诞生十几年来，我们看到一个明显的趋势，就是从最开始在实验室当中解决一些基础的生物学问题，到逐渐向临床方面的应用转化。从一些企业的发展可以看出，最开始叫做测序公司，后来叫做基因检测公司，现在开始出现基因诊断公司，这是一个很明显的趋势。伴随着这一趋势， 首先在样本的多样性、样本质量上就会有新的要求。在临床上，样本质量都比较差，与生物学实验是不可比的。其次，诊断技术在临床上必须满足方便、快捷的要求。以病理科为例，收到多个样本可能需要在一个星期之内得出结果，还要开展其它项目，这就需要更加方便快捷的检测技术。另外，在操作的规范性方面有比较高的要求。生物学实验室可以不断地重复一个实验，获得高质量的数据，发表好论文，但是在临床实践中，一个样本可能只有一次检测机会，需要非常谨慎，否则可能会出现医疗事故。总体来讲，测序技术未来会更注重临床需求和临床要求。临床需求主要是指治疗可及性，即基因检测结果对一个具体病例的治疗有没有帮助。临床要求是指适用、快捷、规范。这是目前高通量测序用在肿瘤诊疗方面的发展趋势。

您认为，产品开发的临床出发点和技术出发点有什么不同？

陈力博士：我们知道，基因检测行业从业人员很多都有生物学实验室背景，对技术方面都比较关注，思维习惯是如何将实验室技术推广到临床。但我们面临着临床上的问题，如刚才所说的临床样本的特点。恒特基因从创办开始，就将临床应用为出发点，作为开发产品的重要考虑因素。这里谈几点，首先我们看到很多检测DNA的产品，检测范围以基因数来算是非常大的，动辄几百个基因。虽然几乎所有肿瘤驱动基因都有靶向药处于不同研发阶段，但成药的不多，看FDA、NCCN等一些机构推荐的靶点屈指可数，所以测了这么多的基因，对科研来讲非常有用，可以做很多统计分析，然而具体到某个病人直接用途是有限的。这是以临床为出发点和以技术为出发点比较明显的一个区别。另外一个是操作习惯的问题，以临床为出发点，则操作越便捷越好。虽然目前做不到全程一键操作，但是可以做很多的整合，比如可以将数据分析的流程串在一起，输入初始数据，只需一个按键就可以得到最后的报告，这是可以做到的。在实验方面，可以做到自动化，比如说移液工作站，加上有限的人工步骤可以较快拿到实验结果。自动化是恒特未来的重点工作之一，对我们有利的因素是PANO-Seq的单管检测流程比较简明，没有分叉或合并，也避免在中间过程设置质控反馈点，这样一个批次所有样本的操作是完全一致的，但又不会混淆。我们希望用一套相同的、相对简易的体系，在恒特医检所及临床单位推广使用。

恒特未来计划怎么推广PANO-Seq这项技术，让临床单位获益？

陈力博士：恒特在开发技术的同时就在进行转化的布局。一项新技术初期推广总是困难重重。PANO-Seq也是一样，虽然它很强大，而且得到了学术杂志的认可，但是想要转化到临床，被临床用户认可，还是非常困难的。恒特在转化方面做了一些具体工作，一方面是恒特医检所，上个月拿到了医检所的资质，目前可以对外收样进行检测。另外恒特也建立了课题项目组，通过与一些临床医生进行合作，来探索解决一些具体的医学科研问题。此外，我们在这次发表的文章中已经总结了一个1000例未经筛选的肺癌回顾队列情况，现在我们启动了一个新的计划，叫做“实体瘤罕见及可作用融合靶点”(Rare and Actionable Fusion Targets in Solid tumor, RAFTS) 计划，又名叫“轻舟计划”。我们希望临床医生、药物研发企业能够参与到这项计划中来，感兴趣的可以联系我们。也包括其他NGS检测公司参与进来，毕竟术业有专攻，一些NGS公司在常见靶点方面做得非常好，我们擅长的是融合基因检测，所以希望大家能合作完成。“轻舟计划”预计同样入组1000例，以肺癌为主的泛阴性实体瘤样本，即排除携带EGFR/KRAS/BRAF/PIK3CA突变及ALK融合等常见靶点的病例，以实现对一些罕见的可用药融合靶点的富集，入组的要求是临床可及的病人，称为临床同期。根据初步数据反馈的结果，预计最终大约可以获得50~100份罕见融合阳性病例，对应的病人有望受益于这一项目，如参与在研靶向药的临床试验。对于新药研发企业来讲，可以获得罕见靶点病人的临床入组。这些是我们要做的转化方面的三个工作。

我们了解到，恒特基因专注于肿瘤基因测序，业务重点是融合基因的检测。恒特未来在技术研发上有什么样的规划？是否还将以检测融合基因为主？

陈力博士：未来，恒特会继续深耕融合基因，做科研到临床的转化和推广，这方面的工作不会停止。血液肿瘤、肉瘤等都是融合高发的肿瘤类型。RNA/DNA共检测提供了很多潜在应用场景。比如说RNA的表达，目前RNA表达生物标志物还是集中在HER2等个别基因，其它基因的表达有没有可能对癌症的病因及治疗有揭示的效果呢？这是我们很感兴趣的一个问题。另外一个，是我们正在规划的TCR（T细胞受体库）方面的工作。此外，我们看到目前免疫治疗占据了半壁江山。而NGS提供的答案，绝大多数还是集中在靶向治疗，在免疫治疗方面的用途还是比较少，除了在肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定（MSI）有一些有限的应用以外，基本上是空白的。目前我们正在做这方面的探索，相信不久会有数据问世。

目前，肿瘤液体活检的临床应用现状如何？您认为该行业未来将怎样发展？

陈力博士：液体活检应用很多，我们主要看看在分子诊断方面的应用。从目前的发展趋势来看，这方面逐渐趋向于成熟，未来会有一些通过IVD认证的产品出来。回到融合基因的检测话题，血浆游离核酸液体活检用于融合基因的检测是比较困难的。相对来讲，其难点不止在于ctDNA比较少，还在于它的片段短（在150bp左右），片段小对与检测融合基因来讲难度很大，因为一个序列里面必须同时包含靶基因序列以及融合伙伴序列，两者都要达到一定长度才能进行基因组比对。PANO-Seq在液体活检方面检测融合也有设定，包括通过检测DNA内含子的序列，覆盖一些常见的融合基因。

感谢您参加本次临床分子诊断研讨会并作演讲，对本次大会您有什么感想？对哪方面的议题感兴趣？

陈力博士：感谢组委会邀请我参加这次大会。转化医学的精髓是从病床边来，回病床边去，即bedside to bench, and back。我们看到，一些医学研究是走完了“bedside to bench”从临床到实验室的转化，获得了科研成果，这是临床医生经常做的，另外一些是走完了“bench to bedside”，从实验室到临床的转化。生物学研究者的擅长。将两个步骤结合起来，这才是真正转化医学的全过程。这项工作需要诊断、临床、治疗方法三方面的共同参与。在会上，我提到了恒特参与的两例NTRK1患者诊断和治疗的情况，就是这样的例子。当时恒特从正在接收治疗的病人的样本中检测出了NTRK1融合，之后临床医生马上使用了一个国内药厂产的靶向药，这一靶向药不是针对该靶点开发的，是一个多激酶抑制剂，但使用之后效果不错，我们也做了细胞学实验证明对NTRK1的抑制作用是特异的。我们很欣慰，这就是一个典型的临床医生、恒特、药厂共同合作使病人受益的一个例子。关于会议内容，我想看到更多的临床医生、患者、新药研发企业从分子诊断专家的工作中实实在在受益的例子，希望下次会议有这方面的代表来参加。

--嘉宾介绍--

陈力博士 恒特基因首席技术官

陈力博士本科毕业于复旦大学遗传学系，于美国佛蒙特大学获得分子遗传学博士学位，后在哈佛医学院及麻省总医院癌症中心长期从事医学遗传学研究，主要研究方向为肿瘤精准治疗相关的基因检测、靶向治疗、基因组学。于2016年参与创办恒特基因并担任首席技术官，专攻高通量测序在肿瘤诊疗中的应用。

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