【聚焦】液态活检助力肺癌精准诊疗

过去二十年间，随着对肺癌相关研究的深入，化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗手段不断推陈出新，肺癌治疗水平得到了长足进步。而肺癌患者的精准治疗离不开分子生物学及诊断科技的发展，液态活检作为新兴的检测技术在肺癌临床中的应用日趋成熟。

沈阳市肺癌诊治中心、沈阳市胸科医院肿瘤内科主任李茵茵

从组织活检到液态活检，肺癌精准诊断进阶

组织活检作为肿瘤诊断的“金标准”，在临床实践中仍存一定的局限性，包括组织活检的滞后性、部分患者因自身条件不适合组织活检、有创的组织活检可能加速肿瘤转移风险、已发生转移的癌症患者组织取样可能无法反映患者整体情况等【1】。此外，就肺癌而言，肺癌同一瘤体的不同位置、肿瘤细胞的分化与基因型均存在差异，是一种高度异质性的肿瘤【2】。当发生疾病进展、药物耐药或癌细胞转移时，肿瘤细胞的亚克隆不断变化，异质性情况更加多元，组织活检因而难以完全覆盖临床的需求【3,4】。

液态活检通过取样脑脊液、唾液、胸水、血液、腹水、尿液等对疾病进行诊断，能在一定程度上避免组织异质性对肿瘤分子分型的影响。基于血液的液态活检是目前最主要的研究方向，主要检测血液中游离的循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）和外泌体（Exosome）。

ctDNA由肿瘤细胞释放到血液中，往往带有肿瘤组织的基因突变信息，能够检测到包含点突变（SNV）、短片段插入缺失（Indel）、融合基因（Fusion）、拷贝数变异（CNV）等各类基因突变，可有效覆盖临床用药所需位点的检测。而CTC通常包含更多的信息，如更完整的转录组、蛋白表达等，但相较于已较为成熟的ctDNA提取和检测，将CTC从大量血细胞中富集出来并加以检测的流程更加复杂。若能获得存活的CTC，对后续个体化医疗动物模型构建将有较大帮助【5】。

李茵茵主任介绍道：“相较于组织活检，液态活检技术具有三大明显优势：一是血检样本可及性更高，可以提升很多晚期和复发患者的样本可及性，规避组织活检存在的潜在临床风险；二是能够避免组织样本异质性与取材的风险，同一肿瘤的不同位置、原发灶与转移灶的分子分型都可能存在差异，而组织活检可能无法对整个肿瘤区域进行全覆盖；三是可多次取样，更易于实现术后微小残留病灶（MRD）以及治疗效果的动态监控。”

分子诊断指导肺癌全程管理，助推精准医疗发展

肺癌液态活检技术主要包括数字PCR（dPCR）、实时定量PCR（qPCR）和二代测序（NGS）三种。其中，dPCR通常用于单位点检测；qPCR用于单基因多位点检测；NGS则可同时检测大量基因的不同突变类型。

qPCR是目前最为成熟的液态活检技术，当前主要应用于检测ctDNA中的表皮生长因子受体（EGFR）突变。以新一代cobas^® EGFR突变检测（cobas^® EGFR Mutation Test v2）为例，其采用等位基因特异扩增（ASA），利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，使ASA引物在野生型DNA上不扩增，减少假阳性率。

一项多中心、开放标签、随机化III期研究试验ENSURE，用于评估厄洛替尼与吉西他滨/顺铂作为EGFR 19 Del/L858R IIIB / IV期非小细胞肺癌（NSCLC）患者一线治疗方案的疗效和安全性，结果表明经cobas^® EGFR Mutation Test v2血浆检出EGFR激活突变的晚期NSCLC患者一线使用厄洛替尼治疗后，无进展生存期（PFS）比化疗有显著提升【6】。另一项II期、多中心研究AURA2试验的汇总分析得出，通过cobas^® EGFR Mutation Test v2检测到血浆T790M阳性的晚期NSCLC 患者可以从一代EGFR-TKI 药物奥希替尼治疗中获益【7】。

cobas^® EGFR Mutation Test v2可识别18-21号外显子区域42种基因突变，包括L858R、19号外显子缺失、L861Q等TKI敏感性突变和包括T790M在内的TKI耐药性突变，是市场上覆盖点位最多的EGFR检测，有助于临床鉴别出更多能从靶向治疗获益的患者。

此外，NGS技术可获得 ctDNA 中各个基因的突变信息，有助于进一步避免肿瘤异质性问题，全面分析肿瘤突变情况，同时在用药监测、MRD监测、血液肿瘤突变负荷（bTMB）监测等方面为临床提供更多的决策依据【8】。然而，NGS在实际应用中仍存在一些问题：如从每份血样中提取获得的游离DNA（cfDNA）都相对较少，样本量有限；cfDNA中仅有极小的部分是ctDNA，存在背景噪音；不同研究对象之间的肿瘤特异性突变也有所不同；同时NGS文库制备流程复杂，各个环节的PCR都可能引入潜在的扩增错误，从而影响检测准确性【9】。

罗氏诊断CAPP-Seq深度测序技术通过在文库构建、数据分析等环节的优化，引入单分子标签方案，有效提升了NGS技术用于检测ctDNA中EGFR突变的特异性与敏感性。

基于AVENIO Surveillance 197 panel动态监测肺癌MRD的临床试验共入组 40 例 Ib III 期局限性肺癌患者，在治疗结束后4个月内首次（MRD界标点）进行血浆ctDNA 分析，之后每3-6个月动态监测ctDNA 水平，结果表明，ctDNA阳性检测可早于72%的影像学诊断的肿瘤复发，中位时间提前5.2个月。无论在MRD界标点，还是全随访病程，ctDNA阳性患者在PFS及疾病特异生存期均显著低于ctDNA阴性患者【10】。

在免疫治疗领域，POPLAR和OAK研究回顾性分析均显示，当bTMB≥16 时，采用 Atezolizumab治疗的NSCLC患者临床获益显著优于化疗，提示bTMB可作为一个独立预测生物标志物【11】。

“基于qPCR的液态活检技术最为成熟，经过充分论证，已大规模应用于临床。dPCR的超高灵敏度在血检中有一定优势，但一次检测位点较少可能限制其后续的应用场景。而基于NGS的液态活检通过动态监测等应用场景，有助于患者的全流程管理，后续有较大潜力，但由于其技术的复杂性，其应用仍需进一步论证与优化。”李茵茵主任总结道，“未来，随着分子生物学技术的进一步发展革新，液态活检的检测灵敏度和特异性将不断提高，液态活检必将成为肿瘤精准医疗中的重要一环。”

参考资料：

【1】Lim C, Sung M, Shepherd FA, et al. Patients with advanced non-small cell lung cancer: are research biopsies a barrier to participation in clinical trials? [J] Thorac oncol, 2016, 11(1): 79-84.

【2】Jamal Hanjani , Mariam, et al. "Tracking the evolution of non small cell lung cancer." New England Journal of Medicine 376.22 (2017): 2109-2121

【3】3Lee, Geewon , et al. Radiomics and its emerging role in lung cancer research, imaging biomarkers and clinical management: state of the art." European journa l of radiology 86 (2017): 297 307.

【4】Govindan , Ramaswamy . "Attack of the Science 346.6206 (2014): 169 170.

【5】Pantel, Klaus, and Catherine Alix Panabières . "Liquid biopsy and minimal residual disease latest advances and implications for cure." Nature Reviews Clinical Oncology (2019):1

【6】cobas^® EGFR Mutation Test v2 CE-IVD Package Insert v4

【7】Jenkins, et al. J Thoracic Oncol 2017

【8】Pantel, Klaus, and Catherine Alix-Panabières. "Liquid biopsy and minimal residual disease—latest advances and implications for cure." Nature Reviews Clinical Oncology (2019): 1.

【9】Corcoran, Ryan B., and Bruce A. Chabner. "Application of cell-free DNA analysis to cancer treatment."New England Journal of Medicine 379.18 (2018): 1754-1765.

【10】Chaudhuri A A, Chabon J J, Lovejoy A F, et al. Early detection of molecular residual disease in localized lung cancer by circulating tumor DNA profiling[J]. Cancer discovery, 2017, 7(12): 1394-1403.

【11】 Gandara, David R., et al. "Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.” Nature medicine 24.9 (2018): 1441.

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