【精华回顾】蔡光伟教授分享染色体芯片vsNIPT在高危妊娠中的应用

蔡光伟教授

香港中文大学妇产科学系副教授

分享内容主要分四部分：

首先，复习了染色体结构异常（CNVs），介绍了拷贝数变异相关的疾病。

第二，基因芯片CMA和NIPT（NGS）检测方法。

第三，CMA和NIPT在高危妊娠临床应用与思考。

最后，进行相关的案例分享。

不论是儿科还是产前，染色体的数目异常我们都是非常了解的。但是其实染色体的数目异常不单是讲唐氏综合征。在儿科，有高于15%的病人染色体数目异常；产前诊断数据也是类似的，但因为样本的不同，所以比率不同。但重要的是，染色体异常不单是染色体数目异常，更重要的是结构异常。现在通过基因芯片的工作最主要讲的是copy-number variants，指某一个染色体可能有片段的缺失（deletion）和增加（duplication）。但是染色体的结构异常也可能有平衡异位和倒位。但蔡教授主要讲基因芯片的技术、二代测序和NIPT方面，所以重点还是关注拷贝数变异。

染色体结构变异（CNVs）与相关疾病

用什么平台来做检测的工作？

因为有些平台可能检不出来片段的缺少还是增加。以他们的基因芯片为例，一般来说最高的分辨率是100kb。

拷贝数变异为什么会致病？

其实主要是缺失有一个hapolnsufficiency，增加有一个triplosensitivity。

产前诊断相关疾病

拷贝数变异在产前诊断方面，颈项结构异常能达到12.5%，唇裂也能达到14.8%。儿科方面，如果讲16p11.2的缺失，先天性脊柱侧弯占7.5%，孤独症占0.4-0.8，肥胖占0.7%%。

通过这个，可以说明拷贝数变异是重要的。因为它也可以有不同的致病机理。那么致病机理跟拷贝数变异的什么位置相关呢？剂量效应和位置效应会影响基因表达剂量的敏感度，而基因断裂和基因融合会导致编码错误蛋白。这几个就是拷贝数变异致病机制的几种模型。

常见的微缺失和微增加的综合征有哪些？

见下图

CMA和NIPT（NGS）检测方法

CMA基因芯片技术是什么？

以前会叫array-CGH或者SNP-array。因为CMA（Chromosomal Microarray Analysis）有两个手段，一个是array-CGH，是安捷伦的一个产品；而SNP-array，来自Affymetrix和Illumina这两个平台，可以检到拷贝数变异。最早在2010年的时候，儿科专家有一个共识，基因芯片应该是一个首选的诊断手段，特别是对于有出生缺陷的儿科病人。现在讲的CMA包含array-CGH和SNP-array。然后通过这样的工作，其实可以增加致病CNV在儿科和产前诊断的一个检测率。

CMA是怎么检到CNV的？

其实，如果仔细看他们的基因芯片的数据，可以看到很多的点，每一个点代表一个探针的位置。叫它基因芯片，是因为它那DNA放在芯片上，根据它的信号的增加跟减少来看有没有变异。那么如何知道探针是增加还是减少呢，要看不同的平台。一般来说呢，一定要有三到五个探针同时是增加还是减少，然后会把它定义为一个信号。

一般一个基因芯片的分辨率是多少？

主要是看它的backbone probe。一般在100-250kb。在相应的有关致病基因方面，有一些芯片会增加密度，有一些就没有了。所以在做检测的时候，要关注这个方面的考虑。

通过这样的工作，蔡教授等人最近把23000多例产前诊断的样本，通过基因芯片进行了分析。其实，致病CNV广泛存在于人们的的基因组，可以发生在所有的怀孕（1.6%），并导致出身缺陷（产前和产后）利用CMA平台检测致病CNV，可以预防和减少出生缺陷。

CNV的特征

大部分的CNV的缺失和增加都是小于1Mb的。不论是从mean还是median，只要0.47。就是说其实大部分它是只有在500kb以下的，所以在做检测时，不论是用新的二代测序，还是基因芯片，要关注的是现在做的分辨率能不能达到能检到已知的致病CNV。在2014年，不管是中国的专家还是外国的相关组织都已经奠定，基因芯片已经是产前诊断的一个首选，是一个金标准。

基因芯片和CNV的位置

第一部分是讲NIPT，这是一个很简单的方法，通过二代测序把母体外周血抽取，然后提取游离胎儿DNA，再分析胎儿DN信号，最后可针对个体的风险进行评估。同时可以通过二代测序的数据量，看到一些小的微缺失和其他染色体。然后进行全基因组测序。

什么叫做二代测序？

先把DNA从不同的细胞提出来，然后把它们随机打断，大概200-500bp。那怎么知道它位置在哪里？其实是先把每个细胞DNA打断，然后用二代测序检出来。再用一个接头（adaptor），把二代测序检出来的一个序列放回基因组。

这个工作上面，要注意两个技术相关的问题。第一，其实做二代测序，是把它打断，然后我们把它进行测序。测序主要有两个，一个是单端测序（single-end sequencing），指数据集是单一方向的；另一个叫双端测序（paired-end sequencing），指在读一个二代测序时，左右两边都读，这样比较容易了解。但是，现在做的更多的还是前者。两者用来做拷贝数变异都没什么大的影响，反而比较重要的是做二代测序的深度（read-depth）。一个整个基因组，大概是3G。如果有90G的可用数据，理论上能读30次，这就是高深度的测序。但是不论国内外，其实讲的是一个低深度高通量的测序。然后第二个，如果只是要看某一个片段的增加跟减少，不一定要看到位点。如果只是看拷贝数变异，就可以用低深度的。

无创已经在国际上面，最多应该是中国，用NIPT作为一线筛查手段。包括美国的ACMG指南，妇产科学会（ACOG），还有欧洲的ESHG，ISPD都是在2015年已经说明，人和病人不论其风险价值高低，都可选择NIPT作为筛查常见非整倍体的方法，但应理解此筛查手段的局限性与优势。

提出问题

基因芯片的优势是可以在产前诊断很精准地提高拷贝数变异的检测率。同时蔡教授也介绍了他们通过二代测序，可以用NIPT的手段，在产前诊断把微缺失和微增加都筛选出来。

通过这样的了解后，然后问题就来了。很多时候，会遇到这样的病人：如果一个孕妇她本身已经是高风险的，那应不应该告诉她应该只做穿刺做芯片，还是首先要做一个无创的全基因组的筛查？那这个问题呢，从2018年起就变成更严重的问题。法国一个团队，他们在JAMA发表了一个很有意思的一个报告。他们报告，在T21高风险的孕妇中，先做无创检测，再视情况做有创检查，与直接做有创检查相比，孕妇的流产风险完全一样。如果穿刺的安全问题不再有争议，那么与扩展性NIPT相比，产前CMA可以全面检测全基因组内染色体异常的优势是否应该引起关注？而且关注点也要看是站在病人还是站在临床大夫的角度来考虑。因为NIPT的阳性预测值，对他们非整倍性（aneuploidies）非常好，同时不会引致增加流产风险。考虑做芯片是因为基因芯片能增加致病CNV检测率。从array上看，最少也是1.6%，它有0.1-0.2%流产的风险。所以，孕妇就会有个疑问，先挑NIPT还是array?基因芯片跟NIPT对比，在高危妊娠中的应用价值。它的应用价值是什么呢？

CMA vs NIPT在高危妊娠临床应用与思考

这就到了第三部分。蔡教授等人希望解答这两个存在争议的问题。他们通过一个多中心，从2015年到2019年收集到单胎高风险有染色体异常的样本。总共是943例，你可能会问为什么是2015年到2019年呢，因为这个工作是要把孕妇定在三个Mb 的分辨率（resolution），同时她们也有做基因芯片的，这个是用他们的CGH+SNP array，定在100个kb的resolution。如果他们本身是高风险的病人，他们研究不讨论也不考虑性染色体异常，只是讲已知的致病CNV异常。

怎么定义高风险的病人？

首先，他们可能只是孕龄（AMA）高风险，35岁以上；另外，他们可能有胎儿超声结构异常，比如唇裂还是颈项？同时，他们可能有唐筛，早孕跟中孕高风险的；另外一种比较少，比如本身他有家族史，就是有染色体结构异常。

通过这个工作看到，最后有744例的妊娠高风险的病人。她们同时进行NIPT和CMA。看到一个很明显的分辨是，总体上NIPT阳性率是58.3%。这个数是指平均每两个高风险的病人，不做全基因组的效果一般。但这类型的病人进行基因芯片后，只有30%的病人有阳性的报告。其实NIPT跟CMA的结果比，semental imbalance一致性只有33%。所以，基因芯片还是非常重要的。

还有个非常严重的问题，有76例芯片跟NIPT的结果其实是不一致的，其中一致的只有13例，不一致的是完全超出一致的。NIPT找的位置跟芯片找的位置完全不同。这是一个很重要的提示。这个也说明像ACMG指南说的，如果NIPT是阳性结果就要进行诊断性的检测。

其实基因芯片在高风险情况下也要做。因为，在NIPS阴性的例子中，基因芯片能检出LOH,UPD和三倍体的存在，都是1.4%。在高风险的病人中，这都是致病性的，但是NIPS平台都检测不到。另外，染色体有数目异常的，也有5例是NIPS检不到的。所以，致病CNV在高风险疑似阴性的病例中，每17例NIPS阴性的都有一例是基因芯片检出阳性的。

总而言之，在高风险的病人，如果进行无创全基因组的检测，阳性可能有58.3%，如果同一个组的高风险孕妇做基因芯片的诊断，其实大概32.7%是阳性的。但基因芯片可以检出小的致病CNV。因为现在做的全基因组的NIPT不能检到很小的片段，就是小于1-3G的。大部分的现在有NIPS的平台检不到，所以不论风险高低，基因芯片都是很有很有必要做的。

（转化医学网360zhyx.com）