癌症早筛液体活检的免核酸提取的qPCR解决方案

      据世卫组织2018年数据报道，癌症已经是全球第二大死因^[1]。 根据Cancer Today 数据显示，尽管中国癌症发病率低于发达欧美国家，但死亡率却远超发达国家^[2]， 癌症早筛的缺乏被认为是造成中国癌症死亡率较高的原因之一^[3]。中国很多癌症患者被发现是已经是晚期，而晚期癌症是非常难治愈的。 因此， 疾病的早期阶段检测诊断癌症，早发现、早诊断和早治疗被认为可有效提高患者的存活率。

_{图片来源：https://gco.iarc.fr/today}

      一般来说，癌症的诊断在临床中最常用的方法就是组织活检。 从患者体内切取、钳取或穿刺等取出病变组织，进行病理学检查的技术。虽然这是临床中最重要的诊断手段，但是对患者有一定创伤性。有一些取样过程，例如肺部穿刺活检，是具有侵入性的痛苦过程，对年迈的病人尤其如此。一般来说癌症的形成一般需要经历10-20年的时间。在细胞刚刚发生癌变但尚未形成恶性肿瘤之前，就会在体液(血液、唾液、尿液、胸腹腔积液等)中出现一些游离的分子——主要包括：循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体等肿瘤来源的生物标志物。液体活检通过采集能代表患者发病部位的体液捕捉这些癌症生物标志物，以获得关于小肿瘤或潜藏肿瘤的信息，对于可疑样本，可以运用传统技术进一步检测。

      与传统的组织活检相比，液体活检更容易实现对多种肿瘤的同步覆盖，从而大大提高早筛效率并降低成本。 同时，液体活检因副作用小、非侵入、有效应对肿瘤异质性、可以反复取样、样本获取方便等优势引起了广大临床工作者的兴趣。在过去的十年中， 液体活检一直受到极大关注，被认为是早期癌症诊断的希望^[4]， 能够提高无症状高危人群的肿瘤早期检出率,帮助临床医生把握肿瘤的最佳治疗时机,有效地提高患者的生存率。在欧洲，项目PROLIPSY正在研究液体活检如何帮助前列腺癌的早期检测。研究人员将对血清中含有高水平蛋白质前列腺特异性抗原的人进行CTCs、ctDNA和外泌体的分析。由此首先鉴别前列腺癌患者，再将恶性肿瘤患者与非恶性肿瘤患者区分开来^[4]。2018年Science上还介绍过一种CancerSeek的方法，对病人血液采样评估了其中循环蛋白水平和ctDNA突变（利用PCR技术），检测和定位了8种手术可切除的癌症^[5]。研究人员对在1005名肿瘤尚未扩散的患者和812位健康对照者进行了检测，结果显示 CancerSEEK检测癌症的特异性高达99%（健康对照者中仅有7人出现假阳性），对癌症的敏感性高达69-98%（取决于癌症类型）。

      基于对肿瘤生物标志物特定分析的qPCR和RT-qPCR技术具有较高灵敏度，目前被广泛用于液体活检CTC 和ctDNA的鉴定。相对于基因测序来说，PCR技术更快速、易操作、成本低。然而CTC和ctDNA的分离通常需要新鲜血液样品或其他能够立即处理的样品，并要求短时间内对其分析，这在某种程度上限制了应用。迈迪安公司近期推出的两种抗抑性qPCR预混液（MDX013，MDX016）是开发检测CTC和ctDNA的液体活检产品的理想选择。这两种预混液可以从血液、尿液或唾液等样本中直接扩增目标DNA或RNA。在有抑制剂存在的情况下，使用这两种抗抑性产品可以提高qPCR效率，便于开发出更简单、快速、灵敏的癌症生物标志物检测产品。

      直接扩增操作流程

      抗抑性 qPCR 预混液

      • 即用型qPCR预混液，专为克服PCR抑制剂设计的特殊缓冲液配方

      • 可从粗裂解液或者富含抑制剂的样本（如尿液，脑脊液，牛奶或血液）中直接扩增DNA

      • 适合在样本有限的情况下进行定量分析

      • 免样本提取，提高样本处理测定时间

      对不同抑制剂存在下的高效PCR扩增

      通过直接对含有不同PCR 抑制剂的样本 进行扩增比较扩增效率。结果表明， 在多种常见PCR抑制剂存在的情况下， 抗抑性qPCR预混液的扩增效率保持在90-110%。

      从各种液体类样本(脑脊液，尿液，牛奶和血液）中高效扩增

分别使用抗抑性qPCR预混液(绿色) 和其他竞品直接从1%-20%全血样本 中扩增富含GC（64%）的DNA片段。使用抗抑性qPCR 预混液（绿色)和供 应商R(红色)和T(蓝色)直接从20%全血 样本中扩增GC含量分别为（A）23% (B) 46%和 （C）64%的DNA。

脑脊液，尿液和牛奶样本

将基因组DNA连续10倍稀释后加入人脑脊液、尿液或牛奶中，分别使用抗抑性qPCR预混液(绿色)和KAPA Probe Force预混液 （红色) 扩增DNA。结果表明， 抗抑性qPCR预混液比KAPA Probe Force预混液灵敏度更高， 在三种样品类型中，都可以更好地检测到更低的浓度的样本。

      抗抑性 RT-qPCR 预混液

• 适用于提取过程

• 不复杂或不耗时的原始样品

• 4x 浓度的预混液可最大限度增加样本加样

• 简单的单管反应液，只需要添加引物，探针和 检测样本

• 适用于检测RNA和DNA病原体的单重和多重检测

      抗抑性RT-qPCR预混液对临床样本中的PCR抑制剂体现出高耐受性

在分别含有10%或20%的唾液拭子(COPAN ESwab 359C)中加入甲型流感病毒，分别使用MDX016(红色)和MDX032(黑色)对甲型流感病毒进行扩增。 结果表明，与普通RT-qPCR M预混液(MDX032)相比，抗抑性RT-qPCR 预混液(MDX016) 使Ct值更提前并且获得更高的荧光信号。 说明，抗抑性RT-qPCR 预混液(MDX016) 对检测原始唾液拭子样本中的RNA病毒性能比普通RT-qPCR M预混液(MDX032) 更优越。

在含5%痰液或不含痰液样本中加入灭活流感病毒的扩增曲 线。结果表明，使用抗抑性RT-qPCR预混液(MDX016) 对含有5%痰液的病毒样本扩增(红色)与使用快速一步 法RTqPCR预混液(MDX032)对不含痰液的病毒样本扩增 (蓝色)一致。相比之下，快速一步法RT-qPCR预混液(MDX032) 对含有5%痰液的病毒样本扩增(黑色)从灵敏度和扩增性能上相比均显著降低。

在含1.25%痰液的样品中加入灭活流感病毒的扩增曲线。结果表明，与标准的快速一步法RT-qPCR预混液MDX032(黑色)相比， 抗抑性RT-qPCR预混液 MDX016(红色)对痰液中抑制剂的耐受性更高。

分别从含有5%(黄色)、10%(红色)和20%(黑色)的粪便提取物中扩增4种病原体（诺如和轮状RNA病毒，腺病毒和空肠弯曲 菌DNA病毒)。结果显示了MDX016在粪便中抑制剂的存在下多重扩增的能力。

*参考文章：

【1】https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/cancer
【2】https://gco.iarc.fr/today
【3】https://finance.sina.cn/fund/jjgdxw/2020-10-14/detail-iiznezxr5985864.d.html?vt=4
【4】Catherine Alix-Panabières. The future of liquid biopsy. Nature 579， S9 (2020) DOI： 10.1038/d41586-020-00844-5
【5】Cohen， J. D. et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 359， 926-930 (2018). DOI： 10.1126/science.aar3247

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