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腾讯登录CRISPR技术：生物领域全面开花
| 导读 | 自新冠疫情以来，CRISPR频频进入人们的视野。CRISPR技术自产生以来已经涉及各个研究领域：作物育种、疾病治疗、分子诊断、高科技结合。 |
自新冠疫情以来，CRISPR频频进入人们的视野。CRISPR技术自产生以来已经涉及各个研究领域：作物育种、疾病治疗、分子诊断、高科技结合。CRISPR可以站在华山之巅，踌躇满志的沉吟：山长水阔知何处！！！
1. 作物育种
CRISPR基因编辑技术在植物研究领域已经全面铺开，主要涉及到农作物的产量、品质、抗逆等农艺性状。同时，CRISPR技术也广泛应用于水稻、拟南芥、烟草等模式植物中以探索植物生命活动奥秘。
CRISPR加速农作物育种。目前，CRISPR技术在水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、棉花等农作物的分子育种研究方向取得了一系列的重大成果。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组，通过设计Cas9编辑系统成功获得了抗白粉病的六倍体小麦和抗白叶枯病菌的水稻，并提高了CRISPR技术的编辑能力，降低了核苷酸的插入或缺失突变；对于基因组比较复杂的大豆，精准、高效的CRISPR技术是其进行基因编辑的首选。中国农业科学院团队利用CRISPR技术成功的进行了大豆基因单碱基替换，建立了大豆单碱基编辑技术体系，实现单个靶基因的沉默，而非RNAi技术沉默整个基因家族。
CRISPR辅助探索植物生命体活动。洞悉植物微观分子活动是近年来植物学研究者比较集中的研究方向。从微观入手到预测植物整体的发育趋势。中国科学院逆境中心朱健康课题组通过CRISPR技术表明DNA甲基化可能是转录因子和植物激素之外的第三个最重要的调节果实成熟因子；厦门大学陈亮研究组利用CRISPR技术还原水稻移码突变的rc位点，呈现了Rc正常位点时的植株表型，探索生命体的本质。
总的来说，CRISPR技术在植物领域的应用相对于人体而言更为全面。随着美国对CRISPR基因编辑植物育种的管制逐步放宽，其他各国也必将放宽管制。CRISPR技术精准、高效编辑高产量、高品质、高抗性的作物也必出现在广袤的田园。
2. 疾病治疗
任何一项技术发展的归宿是服务于人类。CRISPR技术已经应用到疾病的治疗当中，目前最热的几大领域：癌症、HIV、亨廷顿氏舞蹈症、杜氏肌萎缩症、预防失明、治疗慢性疼痛、莱姆病、疟疾等。
CRISPR临床治疗效果良好。CRISPR技术已经在临床上取得良好的效果，无副作用，接近人体。北京大学邓宏魁教授利用CRISPR技术对一名HIV患者进行干细胞编辑移植治疗，并没有副作用表现，而且编辑的干细胞能在人体长时间存在。波兰专家通过体外编辑细胞，产生基因突变，然后直接注射到眼睛，整个编辑的细胞接近光感受细胞。哈佛大学医学院使用CRISPR/Cas9首次在人的造血干细胞中完成对CCR5基因的编辑,并将其成功移植到罹患艾滋病和急性淋巴细胞白血病的患者体内。
德州大学西南医学研究中心研究员利用新的基因编辑酶CRISPR-Cpf1在实验室修复了人类细胞和老鼠体内的杜氏肌营养不良。杜氏肌营养不良症是由体内一个最长基因突变所引起的。当肌营养不良蛋白基因出现DNA错误时，身体不能生产肌营养不良蛋白。通过敲除突变区域或精确修复突变基因，CRISPR-Cpf1介导的基因编辑不仅纠正了杜氏肌萎缩症突变，而且还改善了肌肉收缩能力和强度。
CRISPR辅助细胞治疗。CRISPR技术在癌症治疗中的应用比较广泛，涉及到由基因突变、染色体突变、病原体侵袭等生化因素导致的癌变；也涉及到对基因、细胞、病原体的精准基因编辑层面。四川大学卢铀教授团队利用CRISPR技术编辑T细胞以破坏PD-1，然后将T细胞回输给患者，T细胞活性增强。同时，小鼠实验表明该技术能够应用于胃癌的治疗。美国加州大学研究院利用CRISPR技术对T细胞进行“剪切和粘贴”编辑，将大片段DNA引入到T细胞中，这些大片段将会赋予T细胞更强的功能，可以更高效的去除癌细胞。从整个研究趋势来看，CRISPR技术编辑T细胞以杀死癌细胞将成为研究热点。
Editas Medicine与BlueRock Therapeutics签订战略性合作和交叉授权许可协议。两家公司将各自在基因编辑和细胞疗法方面上的专长和优势进行整合，以期发现、开发、制造新型的基因工程化细胞疗法。两家公司将互相授权对方非独家地使用CRISPR基因组编辑技术和诱导性多能干细胞（ipsCs）技术平台，旨在创建新型的，经CRISPR基因组编辑技术改造的异体多能干细胞（PSC）细胞系，以期在公司的多个相关领域（癌症、神经病学，心脏病学和免疫学）开发出工程化的独特通用型细胞疗法。
CRISPR辅助药物开发、靶点筛选。对于许多癌症药物而言，90%的失败原因是缺乏有效的靶点。而目前广泛使用的RNA干扰(RNAi)筛选，往往只是部分沉默基因表达，并伴有高频率的脱靶效应。CRISPR提供了更高通量和更高精度靶点筛选的手段。英国Wellcome Sanger研究所利用CRISPR技术筛查出涉及肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等癌症的628个具有研究价值的靶点，为药物的开发提供了方向。Michael研究组利用CRISPR技术建立的双敲除体系，检测了21321对癌症靶点基因。并筛选了几个高度可信的靶点进行药物治疗，发现治疗效果较好。
毋庸置疑，CRISPR技术不仅仅可以直接用于基因编辑治疗疾病，还可辅助细胞治疗等手段攻克顽疾，更可以高通量精准筛选药物靶点，提高药物疗效、定向药物开发。
3. 分子诊断
CRISPR技术在分子诊断过程中具有快速、简便、单拷贝、可结合高科技等优点使得其在IVD领域快速铺开。特别是2020年张锋团队利用Cas13结合恒温扩增高效检测新冠病毒的实例，预示着CRISPR技术将引领新一代分子诊断浪潮。目前可用的CRISPR系列蛋白包括：Cas12、Cas13、Cas14及其突变体蛋白，这些蛋白都是以Cas9为基础进行开发的。
Cas9蛋白：Cas9蛋白是最早开发出的CRISPR系统蛋白，约1368个氨基酸，能对DNA进行精准编辑。但是野生型的Cas9蛋白往往存在较高的脱靶效应，而且靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性，所以常常用Cas9的突变体进行基因编辑。突变体Cas9只能切割DNA的一条链，并由两个gRNA引导Cas9切割DNA，降低了脱靶效应，提高基因编辑的准确性。
Cas12蛋白：在CRISPR系统中，Cas12是较大的诊断蛋白，约1300个氨基酸，gRNA长度约42-44 nt。Cas12在特异性区分单链DNA和双链DNA后，它能对单链DNA进行疯狂的切割，精确检测肿瘤基因和病原体。Doudna教授证实了利用CRISPR/Cas12a靶向切割DNA并结合RPA技术可以在1小时内精确检测人乳头肿瘤病毒HPV16和HPV18。当然Cas12有其局限性，仅能检测DNA模板。
Cas13蛋白：Cas13诊断蛋白是一种RNA结合酶，约1400个氨基酸，gRNA长度为64 nt，能够特异性切割RNA。Cas13蛋白能够特异性切割RNA的特性使得其对致死性较强的RNA病毒直接进行诊断，而不需要先转录成DNA，然后利用Cas12进行诊断。特别是张锋团队利用Cas13精确检测SARS-CoV-2病毒的验证，消除了人们先前对Cas13的疑虑。
Cas14蛋白：Cas14蛋白是诊断蛋白中最小的，约400-700个氨基酸，40-70kD，是其它Cas蛋白的一半。但是其gRNA却是最长的，约140 nt。Cas14最有趣的现象是能够对dsDNA和ssDNA进行切割。CRISPR/Cas14在切割ssDNA时没有靶向限制，在靶向切割dsDNA时需要T-rich PAM序列。Doudna教授在继Cas12之后又验证了Cas14能够切割癌基因和细菌基因，实现精确检测。Harrington教授证实了Cas14可以用于宏基因组检测，进行临床筛查病菌。
很显然，单个CRISPR/Cas系统是无法应用于分子诊断、疾病治疗，必须结合其它技术。目前常用到的CRISPR+其他技术为：CRISPR+RPA、CRISPR+LAMP、CRISPR+NGS、CRISPR+SMRT、CRISPR+CAR-T、CRISPR芯片、CRISPR+微阵列等。
可以说，CRISPR的应用必将越来越广阔，涉及作物育种、疾病治疗、分子诊断等各个生物领域，CRISPR技术必将“淘尽千江水，万沙一珠坠。”
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