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多篇客户文章解析CUT&Tag技术应用场景

首页 » 产业 » 企业 2021-05-13 近岸蛋白赞(19)

导读	CUT&Tag技术已经用在组蛋白、转录因子、反式作用因子等全基因组DNA-蛋白质互作的研究。在动物、植物、微生物等实验室常用模式生物和细胞系具有广谱的适用性。

CUT&Tag是一种新的DNA—蛋白质互作研究方法。与传统的ChIP-Seq相比，CUT&Tag技术操作简便，无需免疫共沉淀和超声破碎；细胞起始量低。60-100000个细胞就可以满足需要，且CUT&Tag单细胞技术已经实现；一步完成建库，不需要传统的修复末端，加A，加接头构建文库；信噪比高。CUT&Tag技术特异性强，背景噪音较低；灵敏度强；重复性较好；成本远低于ChIP-Seq。可以说，CUT&Tag技术自问世以来一直受表观遗传学研究者的青睐。

CUT&Tag技术原理：CUT&Tag技术的核心是在Tn5上融合了protein A/G抗体结合功能域的转座体pAG-Tn5。在进行CUT&Tag实验时，首先进行靶蛋白特异性抗体（一抗）孵育，使抗体进入细胞与靶蛋白结合。为了放大信号，同理接着进行二抗孵育。最后孵育pAG-Tn5转座体，使得转座体进入细胞并与抗体结合，这样就把转座体间接的固定在靶蛋白上，随后加入Mg2+，激活Tn5酶的切割活性，打断靶蛋白结合的DNA区域。由于Tn5连有测序接头，在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头，接着提取DNA，进行PCR扩增构建文库（图1）。

2019年7月近岸蛋白质（Novoprotein）在全球首次推出CUT&Tag试剂盒，仅仅一个试剂盒就可以完成从靶蛋白结合DNA片段的获取到测序文库的构建。到目前为止，CUT&Tag技术已经用在组蛋白、转录因子、反式作用因子等全基因组DNA-蛋白质互作的研究。在动物、植物、微生物等实验室常用模式生物和细胞系具有广谱的适用性。

图1.CUT&Tag技术工作原理图

应用场景一：

CUT&Tag技术分析手段——高通量测序（NGS）或qPCR

从作用原理上看，CUT&Tag技术本身属于高通量测序（NGS）系列。CUT&Tag试剂盒本身是一种建库试剂盒，适用于二代测序。这是因为，CUT&Tag技术包含了ChIP实验靶蛋白结合片段的获取和文库构建两部分实验。从客户文章来看，近岸蛋白质CUT&Tag试剂盒的实验结果可以有两种分析手段，或者进行qPCR，检测目的条带的富集情况；或者进行高通量测序（NGS）进行深入分析。

（1）CUT&Tag实验结果进行qPCR分析

事实证明，CUT&Tag实验所获取的DNA片段可以进行qPCR以检测目的条带的富集情况。CUT&Tag-qPCR与ChIP-qPCR类似，定量的长度、方法、引物设计等几乎完全一致。一般的实验流程为：细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育—片段化—DNA提取—qPCR检测。整个实验流程不超过10小时。

图2：CUT&Tag-qPCR揭示Runx1在miR-210和miR-455的启动子区域结合情况

（Xiaoyi Zhao et al.2020）

（2）CUT&Tag实验结果进行高通量测序（NGS）分析

CUT&Tag本身是一种高通量测序技术，最终所获取的实验结果也是测序文库。CUT&Tag的文库与ChIP-Seq类似，都是200-1000bp左右的文库。测序所得的数据可以用常规的分析软件进行分析，无需特殊的分析软件。一般的实验流程为：细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育—片段化—DNA提取—PCR构建文库—文库纯化—质检—测序。整个实验流程约10小时。

图3.CUT&Tag分析SOX15 结合的靶基因

（Xiaoman Wang et al.2021）

应用场景二：

CUT&Tag技术对不同的靶蛋白具有广泛的适用性

CUT&Tag与ChIP-seq一样，对常见的组蛋白和转录因子具有很好的适用性。更为惊奇的是，多篇客户文章证实，CUT&Tag对RAR、CCKBR、TWIST2（转录因子）、JUN、JUNB、PIM1、Runx1、SOX15等DNA直接或者间接结合蛋白都具有很好的适用性。即CUT&Tag技术适用于全基因组范围内的DNA-蛋白质互作研究。

图4.CUT&Tag在不同靶蛋白上的应用

应用场景三：

CUT&Tag技术对不同的细胞样本具有广谱的适用性

CUT&Tag技术对实验室常规的模式生物和细胞系都有很好的适用性。这些模式生物包括人、动物、植物、微生物样本。CUT&Tag技术在HepG2 cell、RAW246.7 cell、KYSE cell、Human primary cell、Human Tissure cell、hPSCs、K562 cell、mouse ES cell、HEK293T cell、mouse MEFs cell、mouse embryos cell、mouse brain cell、NIH3T3 cell、CD4+T cell、HeLa S3 cell、H1 hESCs cell、CD8+T cell、果蝇细胞、muscle stem cell、拟南芥、水稻、棉花等细胞样本中已经得到了应用，可见，CUT&Tag技术对实验室常规细胞样本具有广谱的适用性，含有细胞壁的细胞也适用。