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腾讯登录免疫检测中如何避免干扰引起的假阳性结果？
| 导读 | 在免疫检测中，非常有必要使用专门的免疫阻断剂来降低这些干扰引起的假阳性结果，从而提高检测结果的准确性。 |
在免疫检测中，比如ELISA，CLIA或者侧向流免疫检测中，嗜异抗体(HA)，人抗鼠抗体(HAMA)和类风湿因子(RH)会通过与抗体的非特异性结合而降低检测的灵敏度和特异性，导致错误结果和诊断。 因此，非常有必要使用专门的免疫阻断剂来降低这些干扰引起的假阳性结果，从而提高检测结果的准确性。
如何选择合适的阻断剂？
阻断剂的选择取决于试验的预期应用、样品类型、 试剂的可获得性以及该试验预期用于一个实验室的单个分析还是由各种技术人员在很多实验室使用。一般来说, 免疫分析分为以下几类:
(1) 夹心抗原检测 ELISA - 用于测量目标抗原/分析物的数量
(2) 抗体捕获 ELISA - 用于筛查特异性靶标的抗体(例如：lgG,、lgM,、lgA, & lgE)
(3) 竞争性ELISA - 用于检测样品中存在的抗原/分析物, 并且通常用于只有 1-2 个表位的小抗原
在所有检测中有几个对检测性能至关重要的常见参数:
• 固相的选择 (2)
• 抗体/抗原的选择
• 阻断剂的选择。
为了使一个试验同时具有高灵敏度和特异性,最关键的因素是选择对目标分子具有高度特异性的抗体或抗原。但是, 使用阻断剂也有可能提高试验的灵敏度和特异性。这些阻断剂的功能是减少使信噪比增加的非特异性结合。
试验中的非特异性相互作用可发生在：
(1) 固相与非靶定蛋白之间, 其吸附在固体底物的表面
(2) 试验本身包含的抗体与患者样品存在的内源性抗体之间。
为了防止非特异性结合, 在固相包被步骤之后使用封闭缓冲液以阻断所有剩下的开放结合位点。在样品制备过程中使用其它阻断剂来防止干扰抗体与试验抗体成分结合。
图 1 迈迪安山羊抗人IgG抗体和固相封闭液的通用使用流程
迈迪安的阻断剂系列包括主动阻断剂，如TRU Block™， 和被动阻断剂，如小鼠IgG。其中TRU Block™ULTRA(新一代HAMA阻断剂)是经过多年研发目前市面上最强大的免疫分析干扰阻断剂。它可以在侧向引流和ELISA检测中全面抗HAMA, HA和RF的干扰。IVD制造商能够在较低浓度下使用这种主动阻断剂，并实现更高的检测性能。
阻断固相
固相定量免疫分析比如ELISA、层析法和Western blot（蛋白质印迹）都是将抗体固定于一个表面。其它蛋白质或生物分子与该表面的非特异性结合会降低试验的特异性和灵敏度。固相阻断剂专门用于使未被结合的结合位点饱和, 从而防止非特异性结合, 同时增加检测灵敏度。
在开发一种新的免疫分析检测时, 第一步就是优化固相上的抗原或捕获抗体包被条件以使包被的蛋白质数量最大化。
包被完成后, 必须阻断所有剩下的未被结合的结合位点以防止后续反应物的非特异性结合。理想的阻断剂通常基于蛋白质,因为它既能阻断固相上的疏水位点又能阻断固相上的亲水位点。另外,蛋白质在固相表面反应时它还可以作为稳定剂和防止变性作用。必须优化每个试验的阻断剂浓度和阻断时间长短。使用数量不足的阻断剂会导致背景过剩和信噪比减小。使用过量浓度的阻断剂可能掩盖抗体抗原相互作用, 导致灵敏度降低。
理想的阻断剂具有以下特征:
• 有效地阻断试验反应物与微孔表面的非特异性结合
• 不会破坏已吸附到微孔的试验成分的结合
• 充当固相上试验反应物的稳定剂（防止变性作用）
• 不与其它试验反应物发生交叉反应
• 不具备可能导致底物信号产生或反应物降解的酶活性
• 各批次间性能如一
没有封闭缓冲液的ELISA
未结合的碎片比如蛋白质、患者样品中的干扰分子、和试验反应物与固相结合并与特异性抗原-抗体反应产生竞争,导致背景 噪音和特异性试验信号减少。
有封闭缓冲液的ELISA
封闭缓冲液用于与固相上的开放位点结合, 避免未结合碎片的非特异性结。
迈迪安提供的性能优质的固相封闭剂包括：
阻断检测干扰
免疫分析干扰的背景信息
免疫分析干扰是对通过导致假阳性或假阴性测试结果而改变试验结局的物质的总称。 例如, 潜在干扰颗粒包括患者样品中存在的内源性抗体或其它结合蛋白, 多反应性抗体或自身抗体（异嗜性）以及人抗动物抗体。
在免疫分析中，干扰物质通过以下任一方式产生破坏分析物与试剂抗体之间反应的非特异性反应: (1) 在与待测分析物竞争结合试验抗体中胜出（假阴性）或 (2) 在没有任何分析物的情况下同时与试验的捕获抗体和检测抗体结合（假阳性）。
内在易受干扰影响的试验包括双夹心抗原检测试验，竞争性试验和lgM捕获试验。文献中已报道的具体例子有ToRCH、CEA、CA-125、CKMB、LH、FSH、催乳素、TSH、AFP、心脏肌钙蛋白I (cTnl) 和hCG等试验。
夹心法和竞争性试验中最常见的干扰类型是异嗜性抗体（HA,）， 这种抗体是自然生成的亲和力较低的人抗体，可与不同物种的免疫球蛋白发生反应, 包括小鼠、山羊、小兔、绵羊和小鸡。在诊断试验中，HAs能够与多个看似不相关的表位结合来破坏试验的特异性抗原抗体作用。
人抗鼠抗体 (HAMA) 是其中一种HA干扰, 与小鼠抗体特异性结合。 由于商用诊断免疫分析较多使用小鼠单克隆抗体, 所以 HAMA 干扰是最多见的一种类型。类风湿因子（(RF)）是一种自身抗体, 可与患者自己的免疫球蛋白（(Ig)）发生反应, 也可能与动物 Ig 交叉反应导致 “RF 干扰” , 这与 HA/HAMA 干扰类似。一般来说, 同型（(Fc区) 特有的干扰HA比个体遗传型（(Fab或结合位点）特有的HA更常见。
IgM 捕获试验一般有两种干扰。第一种来自高水平的患者IgG抗体, 与IgM 竞争固相上的抗原结合位点。由于IgG 抗体非常丰富, 约代表了人血清抗体的 75%，因此它们凭借绝对数量优势在竞争中胜过IgM。第二种干扰是由IgM RF导致, 通过与免疫球蛋白上的Fc片断反应产生假阳性信号。RF见于 1%-4% 的普通人群和 75% 的 65 岁以上成人患者。
夹心免疫分析干扰
夹心免疫分析使用两种抗体（单克隆或多克隆抗体）来结合抗原或待测分析物上的不同位点。捕获抗体对抗原的结合亲和力通常是免疫分析灵敏度的主要决定因素。但是, 人抗动物免疫球蛋白抗体（HA抗体）会干扰这一相互作用并降低检测灵敏度和特异性。
IgM 捕获试验的干扰
IgM 抗体是免疫系统响应感染而产生的第一种抗体。因此, 已证实lgM检测试验是很有价值的诊断工具, 有助于鉴别早期和近期感染。然而, lgM 抗体在体内所有抗体中只占5%-10%。相比之下, lgG 抗体是最丰富的免疫球蛋白, 约占 75%-80%。为了确保 lgM 试验同时具有高灵敏度和特异性, 有必要减少试验干扰, 尤其是来自更加丰富的 lgG 抗体和其它非特异性蛋白的干扰, 比如类风湿因子（RF）。
迈迪安是全球领先的免疫阻断剂生产商， 提供的阻断剂系列包括主动阻断剂，如TRU Block™， 和被动阻断剂，如小鼠IgG。其中TRU Block™ULTRA(新一代HAMA阻断剂)是经过多年研发目前市面上最强大的免疫分析干扰阻断剂。它可以在侧向引流和ELISA检测中全面抗HAMA, HA和RF的干扰。IVD制造商能够在较低浓度下使用这种主动阻断剂，并实现更高的检测性能。
用于消除免疫夹心法干扰的阻断剂
动物IgG – 被动阻断剂
• 适用于混种试验（例如, MAb/PAb)
• 阻断剂的种类必须与捕获抗体或检测抗体宿 主的种类一致
被动阻断剂通过提供替代结合位点阻止干扰抗体与捕获抗体或检测抗体结合。动物IgG (例如,羊IgG) 只能阻断一种干扰类型 (例如, 人抗羊抗体), 因此通常需要不止一种IgG, 这取决于捕获抗体和检测抗体的宿主。必须添加过剩浓度的动物IgG, 其效果取决于干扰抗体与动物IgG的亲和力。
TRU Block™ – 主动HAMA & RF阻断剂
• 用于双鼠单克隆试验
• 除去HAMA, HA & RF干扰
在双鼠单克隆试验中, 需要使用特异性阻断剂来除 去特定类型的HA干扰, 称之为人抗鼠抗体 (HAMA) 和类风湿因子 (RF)。HAMA阻断剂包含一种针对所 有类型异嗜性干扰包括HAMA和RF的特异性粘合剂。 一旦与干扰抗体结合, TRU Block会通过位阻进一步阻止HA与其它试验成分结合。主动阻断剂的使用浓度通常低于被动阻断剂, 使一般与被动阻断剂有关的试验信号减少最小化。
TRU Block™ ULTRA 是一个功能强大的HAMA和RF 阻断缓冲液，可用于双鼠单克隆实验中以减少实验干扰。它优越的性能经客户实验证实，在商业ELISA和侧向流动实验中提高检测性能. 内部研究（如下所示）也证实 TRU Block™ ULTRA阻断剂比小鼠IgG和竞争对手的主动HAMA阻断剂更有效。
三个不同的双鼠单克隆三明治化验（商业CA19-9, 商业FSH 和内部RF实验）被用来比较TRU Block™ ULTRA， 小鼠IgG 和另一个竞争对手的主动HAMA阻断剂的性能。 为了量化每个人血清中HAMA或RF活性的相对含量，实验中使用了不含小鼠IgG 和其他阻断剂的稀释缓冲液，按照制造商的使用说明进行实验。 含有TRU Block™ ULTRA ，小鼠IgG或者竞争阻断剂的阻断液使用同样的稀释缓冲液各制备了四个不同浓度 (5 μg/ml, 2.5 μg/ml ，1.25 μg/ml 和0.625 μg/ml).
通过相对抑制HAMA或者RF信号 （即比较没有阻断剂的样品和有各种阻断剂的样品的吸光度）来决定各种阻断剂的有效性。 HAMA阳性血清来自于 Scantibodies, Inc. (SD386-1) 和 BioReclamation (BRH56382). 另一个样本来自于罗氏 (罗氏 Type 1)，含有罗氏专有HAMA的普通人类血清。 RF血清样品 由迈迪安公司内部提供，产品编号为 A12916H 和A01270H （可从迈迪安公司的产品目录 www.meridianlifescience.com上查询购买）。研究结果表明，在所有测试的HAMA和RF血清样本中，TRU Block™ ULTRA 的性能相当于或者由于竞争对手的主动阻断剂。
用于消除IgM捕获试验干扰的阻断剂
IgG吸附剂
IgG 吸附剂是纯化的羊抗人IgG (GAH IgG Fc) Fc片断, 用于在ELISA或其它免疫分析检测特异性IgM抗体之前从血清中除去人IgG 宋体IgG/类风湿因子 (RF) 复合物。已证明除去IgG干扰能够显著增加免疫分析检测IgM的灵敏度。 -Meridian的IgG吸附剂是用免疫电泳法检测的, 以确保 IgG特异性和不与IgM或IgA交叉反应。
IgM检测稀释液
IgM检测稀释液预期用于检测IgM抗体的定性和定量试验。该稀释液旨在减少患者 IgG抗体、类风湿因子、异嗜性抗 体和会影响免疫分析结果的其它非特异性蛋白给试验带来 的干扰。 IgM检测稀释液中的阻断蛋白是过量的, 将与检 测固相上的任何开放结合位点结合以防止与干扰因子结合。作为检测试剂盒的一部分时, IgM检测稀释液能够增加IgM 检测试验的灵敏度。
同型对照&其它阻断剂
同型对照在流式细胞术和免疫组化试验中用作阴性对照, 可区分非特异性背景信号与特异性抗体信号。另外, 人免疫球蛋白可用于测量患者样品中的免疫球蛋白/同型的种类, 作为标准的阻断剂或作为蛋白包被剂用于包括免疫荧光、 免疫细胞化学、蛋白质印迹 (Western blot) 和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
同型对照是对目标抗原缺乏特异性的一级抗体（一抗), 但是与应用中使用的一级抗体的类与型相符。它们通过阻断Fc受体与细胞蛋白、糖类和脂类结合或非特异性蛋白与之相互作用来减少一抗/捕获抗体的非特异性结合。同型对照抗体应该与一抗/捕获抗体的宿主种类、同型（包括重链 (IgA, IgG, IgD, IgE或IgM) 和轻链 (kappa或 lambda) 类型）相符, 如果相关, 酶结合物也要相符。此外, 同型对照应该在一级抗体的相同浓度下使用。
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美国迈迪安生命科学公司是一家大规模生产各种抗体，各种病毒抗原，各种重组蛋白质，各类PCR多聚酶，各种核苷酸和体外诊断关键试剂的大型领军企业。40年以来，迈迪安生命科学公司始终坚持以提供创新的生命科学解决方案和建立值得信赖的合作伙伴关系为我们的宗旨。我们的重点是为体外诊断试剂公司提供优质的原料和服务，使其有助于推动这些领域的发展。
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