LAMP检测开发技巧及关键原料选择

等温扩增技术（isothermal amplification technology，ITA）是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术， 其中LAMP（ loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）因其反应快速、特异高、设备简单易操作、结果易于鉴定等优点，已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域，并且还将广泛应用于临床传染病诊断、环境监测、食品安全等领域，已经成为一种适用于分子POCT平台的理想方法。

LAMP与qPCR各有优势，在之前一文中具体阐述过，点击下方链接可阅读原文：

迈迪安生物科技公司（Meridian Life Science）早在 2010 年首次利用LAMP技术开发出了第一个用于诊断艰难梭菌的商业化诊断试剂及设备Alethia®。 从那时起，我们在Alethia®平台上开发并商业化了一系列用于传染病诊断的检测试剂，比如 A族和B族链球菌、I型和II型单纯疱疹病毒、百日咳，肺炎支原体，衣原体、淋病和疟疾等。Alethia® 的系类产品全部采用冻干试剂。

迈迪安作为全球诊断厂商首选的上游原料试剂生产商，提供一系列开发LAMP检测的高性能Bst酶，免提取抗抑性LAMP反应液，可冻干/可风干LAMP试剂等，为开发LAMP检测提供完整的解决方案。

今年以来，我们了解到越来越多的IVD厂家开始介入LAMP领域的开发，因为LAMP反应引物设计较繁琐，相较于qPCR来说也更容易出现假阳性，因此对研发和优化有一定的技术要求。 为了帮助各位同仁更深入了解LAMP技术，迈迪安生物科技与北京蓝谱生物技术联合准备了一场LAMP专题直播（2021年9月1日晚8-9:30）。 扫描下图中二维码即可报名预约直播。直播内容包括LAMP反应原理及引物设计、反应优化及核心原料选择，并有现场答疑。

LAMP

1．原理：

LAMP环介导等温扩增是在2000年由日本荣研化学株式会社纳富继宣博士发明的一种简单、快速、准确、便宜的新型基因扩增方法（1）。该技术主要特点是用到4-6个识别目标DNA 特定区域的引物。扩增反应首先由链置换聚合酶(如Bst) 和两个特别设计的引物引发形成环状结构，引起随后几轮扩增后产生大量的DNA。LAMP反应对抑制物的耐受性比较高，可以在短时间内快速扩增产生大量的DNA产物， 因此可以实现基于浊度的可视化检测。 通常来说，1 - 10个DNA拷贝可在15-60分钟内扩增获得 10^9 – 10^10 拷贝的DNA产物，是灵敏度和特异性都很高的扩增方法,只需要根据扩增反应产物的 有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。

2．特点：

• 不需要使用双链DNA先变性成为单链

• 扩增反应在等温下可持续进行

• 扩增效率极高

• 针对六个区段使用四种不同的引物，特异性高

• 仅使用一种链置换型DNA聚合酶（如Bst酶）,成本低

• 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构

• 当模板是RNA时，仅需要加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。

LAMP反应局限性在于引物设计繁琐，易出现非特异性扩增。并且由于其高灵敏度，容易形成气溶胶而造成假阳性从而影响检测结果。

3. 操作步骤

LAMP反应操作简便，只需要如下图将样本与配置好的试剂混合，在60-65°C保温约1小时即可以检测扩增产物或者判定扩增反应发生与否。

4. 反应优化

LAMP反应优化主要需要考虑一下几个参数：

• 引物

LAMP反应需要根据目标基因的以下 6 个不同区域设计 4 种类型的引物：3' 端的 F3c、F2c 和 F1c 区域以及 5' 端的 B1、B2 和 B3 区域⁽²⁾。

FIP ：FIP引物在3' 端含有与 F2c 区域互补的 F2区段，在5' 端含有与 F1c 区域相同序列的区段

F3 引物：F3引物含有与目标DNA上的F3 序列相同的区段

BIP：BIP引物在3' 端含有与 B2c 区域互补的 B2区段，在5' 端含有与 B1c 区域相同序列的区段

B3 引物：B3引物含有与目标DNA上的B3 序列相同的区段

正确的引物设计是成功进行LAMP扩增的关键。推荐使用设计LAMP引物的专用软件PrimerExplore^（3）设计引物，设计中应特别注意碱基组成、GC含量和二级结构等问题。Tm 值可以通过最近邻法（Nearest Neighbor法）获得。

引物设计的要点:

1.引物区域之间的距离

· F2的5'端与B2的距离为120-180bp，F2与F3以及B2与B3的距离为0-20bp。

· 成环区域（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）的距离为40-60bp。

2.引物区域的Tm值

· 在富含 GC 和 正常的情况下约为 60-65°C，对于富含 AT 的约为 55-60°C。

3.引物末端的稳定性

· 从以下末端区域计算 6bp 的 dG 应小于 -4kcal/mol，F1c/B1c 的 5' 末端和 F2/B2 的 3' 末端以及 F3/B3。

4.GC含量

· GC 丰富和正常的情况下约为 50-60%，AT 丰富的情况下约为 40-50%。

5.二级结构

· 引物的设计应使其不易形成二级结构。3' 端序列不应富含 AT 或与其他引物互补。

6.其他

· 如果目标序列上存在限制性酶切位点，除引物区域外，可用于确认扩增产物。

在某些情况下，扩增了阴性样本或观察到非特异性反应。引起这种情况的可能原因及解决方法：

(1) 气溶胶污染：通过更换新的试剂、彻底清洁仪器和设备有助于避免污染

(2) 形成引物二聚体，并由此进行扩增：引物设计不当，需要重新设计引物

引物的设计对LAMP反应质量有极大的影响。建议在不同的反应温度下多测试几套引物，选择结果最好的一套最为最优的引物。

• 酶

迈迪安提供的LAMP预混液中，各组分包括Bst酶浓度已经过优化，方便用户直接使用而无需进行额外优化步骤。但是如果您使用的是单独的Bst酶进行反应配置，建议多测试几个不同的酶浓度以比较反应的性能，最理想的结果应为最低背景的情况下反应时间最短。

• 反应温度

LAMP反应温度通常在60-65°C，建议通过温度梯度测试，来选择出不影响TTR的最高温度为反应的最优温度。

• Mg离子

增加镁浓度会减少TTR时间，即反应更快速。但如果太高，会影响背景的增强， 建议通过梯度测试，选择最优的Mg离子浓度。

• 样本质量

虽然LAMP检测比qPCR反应更稳健，对一般样品中的抑制物耐受性更高，但是样品如果经过预处理或者使用抗抑性反应液（如迈迪安MDX019）能得到更灵敏特异性的结果。

为开发不同的LAMP检测，对应的产品搭配推荐如下：

相关其他链接：

。迈迪安可冻干LAMP试剂（点击此处查看详情）

。迈迪安可冻干RT-LAMP一步法试剂（点击此处查看详情）

。免核酸提取LAMP直扩检测的Bst缓冲液（点击此处查看详情）

参考文件：

（1）Eiken Genome Site：http://loopamp.eiken.co.jp/e/

（2）北京蓝谱生物资料：http://www.beijinglanpu.com/news/78.html

（3）PrimerExplore LAMP引物设计软件：http://primerexplorer.jp/e/

迈迪安生物科技是一家全球领先的生物诊断试剂上游原料企业。专业研发生产各种优质的抗原抗体、免疫阻断剂、PCR聚合酶和优化的预混液、核苷酸等免疫和分子诊断试剂关键原料，为人体、动物、农业、环境及食品安全等各种检测提供全面的解决方案。44年来，迈迪安已经成为全球各领域诊断企业的首选原料供应商！迈迪安始终坚持以提供创新的生命科学解决方案和建立值得信赖的合作伙伴关系为我们的宗旨。为体外诊断试剂公司提供优质的原料和服务，使其有助于推动这些领域的发展。