【热点】CTM和CTD联合发表社论：单细胞测序能否作为临床血常规项目？

单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以作为临床生化常规检测手段在疾病诊断和病情严重性，分期、特异性和治疗反应等方面发挥作用吗？从scRNA-seq中获得的综合信息可以对临床治疗方案的选择和精准医疗的实施提供帮助吗？循环系统中的血细胞在维持系统稳态，器官间信息交流以及对病原体进行应答等方面都发挥了关键作用。目前临床生化检查中已经包括血常规检测和血液的特检项目。循环血细胞的数目，组成和分化状态在临床评估中发挥了十分重要的作用。目前对循环血细胞的检测包括细胞形态学检测，化学染色和免疫化学标记等。根据1982年第一届世界人类白细胞分化抗原工作组达成的共识，人们根据循环血细胞表面抗原单克隆抗体的分类情况建立了分化抗原（CD）的命名系统。人们根据单克隆抗体免疫荧光染色阳性情况对循环系统中的白细胞分化抗原进行了识别和分类。

2021年11月19日，Clinical and Translational Discovery 杂志和 Clinical and Translational Medicine 杂志共同发表了复旦大学附属中山医院王向东教授团队的重要社论 “Can single-cell RNA sequencing reshape the clinical biochemistry of haematology? New clusters of circulating blood cells”[6]。

随着生物科技的迅速发展，scRNA-seq已经称为疾病生物标志物检出和验证的重要方法。此外 scRNA-seq 在单细胞研究中也是关键性的技术手段。scRNA-seq技术本身还处于不断发展的阶段，表现为根据临床实践（包括标本的采样，恢复，质控，测序深度，数据挖掘和分析，临床解析和费用等方面）的需求scRNA-seq 正不断进行迅速地改进。不论是生理还是病理情况下，单细胞 DNA 测序和单细胞 RNA 测序相结合都可以提供更加全面，关于细胞膜，细胞器，细胞浆内因子和核元件的信息。越来越多的研究关注于循环血细胞 scRNA-seq在各种疾病中的应用。scRNA-seq 在疾病特异性生物标志物的发现过程中发挥了十分重要的作用。在经历临床前和临床验证阶段之后，可以把scRNA-seq 做成方便使用的诊断试剂盒。从临床医学和转化医学的角度来看，还有一些问题需要重点考虑：（1）scRNA-seq 的重复性，稳定性和可靠性是否已经达到临床应用的标准；（2）scRNA-seq 给临床工作带来了怎样的特殊帮助；（3）是否对循环系统血细胞 scRNA-seq 的研究对 CD 命名系统有所帮助；（4）scRNA-seq 检测获得的 CDs 产物是否可以进一步经过验证和标准化，然后作为常规的血液生化检测项目。

scRNA-seq单独或与其它方法（例如质谱流式细胞术，RNA测序，流式细胞术或蛋白质组学等）联合应用已经发现了新的循环血细胞类型。多种技术方法联合应用可以提供更具综合性的信息，从而有助于对细胞分型和细胞特性以及相关生物学功能进行更加深入的了解。虽然如上的这些检测方法目前还无法常规在临床进行，但是在优化和促使 scRNA-seq 所获信息（包括疾病的严重程度，病程发展和治疗反应性等方面）标准化方面还是发挥了十分重要的作用。

因为 scRNA-seq 不仅可以帮助在多种新发现的疾病（例如COVID-19）中找到新的循环细胞类型，从而有助于了解疾病的系统免疫状况，而且 scRNA-seq 还有助于阐明疾病的发病机制，所以scRNA-seq 越来越受到人们的重视。在 COVID-19 患者的循环细胞单细胞图谱中用 scRNA-seq 检测外周血单个核细胞（PBMCs）的转录组学信息，目的是探讨 COVID-19 患者外周血免疫细胞在疾病状态下发挥作用的分子机制以及寻找新的免疫细胞亚群。有研究表明与典型的急性窘迫综合症和健康对照相比，7例重型 COVID-19 患者存在 γδT细胞，类浆细胞样树突状细胞（pDCs）和 CD56阳性自然杀伤性细胞（NK）的耗竭和浆母细胞的增加。另一项研究通过单细胞转录组学和蛋白组学研究表明重症 COVID-19 患者会出现急性髓细胞增殖，成熟中性粒细胞和HLA-DRlo单个核细胞功能异常等现象。此外在如上研究中还发现，在轻症COVID-19 患者体内有 CD14+HLA-DRAhi，CD14+HLA-DRB1hi和CD14+CD83hi单个核细胞，而在重症COVID-19患者体内发现了CD24+，PGLYRP1+，DEFA3+，DEFA4+，FCGR3B+，CXCL8+和 LCN2+的中性粒细胞。在对中等严重程度和重型 COVID-19 患者非编码 RNA 和 mRNA 的多转录组测序研究表明，外周免疫细胞的非编码RNA和编码mRNA的转录状况与COVID-19的发病有关。

和转录组学和 DNA 甲基化研究一起，scRNA-seq 曾被用于 35800 多份COVID-19外周血样本的动态检测（分别在入院当天，入院后第2，7，10，13天和/或出院当天进行检测）。检测中可以发现COVID-19患者的单核细胞，淋巴细胞和NK细胞分群出现了变化。在这些细胞分群中，康复期 COVID-19 患者的CD14+单核细胞有增加，非典型CD16+单核细胞，浆母细胞和一些骨髓来源的造血祖细胞在COVID-19疾病发展期和恢复早期有增。此外还对 COVID-19患者的全血，PBMCs，单核细胞和淋巴细胞进行了scRNA-seq 检测，旨在发现新的细胞亚群。结果表明在重症监护，严重感染性疾病以及在疾病大流行时发现了新的细胞亚型。scRNA-seq 还在细胞信号网络，功能机制和靶点检测等方面发挥了越来越重要的作用。与单细胞 TCR 测序，深度 TCR 全测序和 HLA 基因型检测相结合，恢复早期 COVID-19 患者的 PBMCs scRNA-seq 检测显示患者有新的单细胞基因表达，出现配对的 αβTCRs 和免疫受体的高可变区，这些成果为 COVID-19 的疫苗研发提供了新的靶点。要想完成精心设计的研究还是充满挑战的，困难来自要有足够数量的样本，要有根据疾病的严重程度，病程，分期和遗传学背景进行分组设计的对照组，以及如何清晰定义不同细胞群体之间的相关性和相互作用等。但是研发可以预测疾病风险，筛查并检出疾病阳性患者的循环血细胞检测试剂盒还是很有发展前途的。

随着 CD 数目的不断快速增加，临床实验室已经可以对细胞表面抗原和细胞分化状态进行精准的检测，虽然每次试验可以标记的抗体数目还是有限的，且随着标记抗体数目的增加所需要的血液样本量也会随之增加。用流式细胞仪同时检测多个免疫表型，并记录细胞的分化状态，发现新的细胞群体，是十分具有挑战性的。而 scRNA-seq 则可以克服这些难题，实现对循环系统血细胞分群，分化状态，分子功能和生物学相互作用的同时检出。目前用scRNA-seq 可以检测出近 100 种循环血细胞亚群和分化状态。这些参数在不同人种，年龄，性别，疾病种类，疾病严重程度和分期以及疾病急性和慢性期都存在差异。Song 等人对多种疾病（包括稳定期肺炎，非稳定期肺炎，哮喘稳定期，急性哮喘发作，慢性阻塞性肺疾病急性发作期，慢性阻塞性肺疾病，肺癌等）患者进行了 scRNA-seq，流式细胞术，质谱和非单细胞 RNA-seq的检测，旨在探讨细胞内和细胞表面蛋白质组学和循环免疫细胞 RNA以及单细胞转录组学信息。研究表明循环系统免疫细胞分群和分化在不同疾病状态，急性和慢性期，都存在差异。当然所获得结果还需在更大人群内进行验证和深入研究。

在癌症的研究中 scRNA-seq 被广泛用于癌组织新型炎症细胞的检出，以及肿瘤微环境中细胞间的相互作用研究。为了更好地了解炎症细胞在肿瘤发生和发展中的作用，人们用 scRNA-seq 监测是否肿瘤组织中疾病特异性炎症细胞与循环系统中的白细胞之间有动态的交流，同时人们需对循环系统中的白细胞进行 CD 表型进行监测。此外人们还用 scRNA-seq 绘制肿瘤组织在不同情况下（包括化疗前和化疗后，以及同一肿瘤患者在不同疾病时期）肿瘤细胞和炎症细胞图谱。研究表明肿瘤组织中炎症细胞的分群和分化在疾病不同分期，治疗前后时都存在动态变化。

另外有人研究是否可以在循环血细胞中检测出新的炎症细胞亚群，以及其临床意义。例如人们根据单细胞转录组学信息，在类风湿性关节炎或骨关节炎患者关节组织中发现了18种独特的炎症细胞亚群，生物信息学研究发现这些细胞亚群与类风湿性关节炎或骨关节炎的发生有关。

对慢性镉接触的人进行循环免疫细胞 scRNA-seq 检测，结果表明大量接触镉的患者会出现CD14+单核细胞减少。CD8+ T细胞的数量和功能状态与机体对炎症和癌症的系统免疫应答情况有关，因此scRNA-seq可以在公共卫生和疾病预防中发挥重要作用。在试验性急性和慢性病毒感染中 TCF1+ 祖细胞样细胞群存在差异。ATAC-seq 和 scRNA-seq 研究表明，在癌症和炎症中CD8 T细胞的功能和分群存在差异。这些与机制相关的信息十分有助于临床实践以及多种疾病治疗靶点的设计。

从 scRNA-seq 中获得的综合信息极大促进了人们对基因组，转录组和表观遗传学的了解和相关领域的进展。但是挑战依然存在。例如把循环细胞的scRNA-seq 信息与组织和器官内细胞的基因特征，新细胞类型标记和功能状况进行关联是十分困难的。目前急需对不同类型脑细胞的功能分群进行临床前和临床阶段的研究。这项工作极具挑战性，因为脑部的发育，健康和疾病状态的分子机制都十分复杂。脑脊液单细胞转录组学信息与循环系统中肿瘤细胞的信息相关，说明转移病灶的空间异质性，以及细胞周期基因和癌症相关抗原的异质性。在液体活检中如果循环系统来源的细胞在分群和分化方面可以与脑脊液，胸腹水和关节液等处的细胞信息有关联，那么 scRNA-seq 将会发挥更大的作用。

另一项挑战是细胞在微环境中的生物学行为是动态变化的，这是静态的检测手段难以监测到的。多个蛋白因子，细胞，信号通路和代谢过程参与了微环境的形成，以及细胞的生存，增殖和迁移等活动。scRNA-seq与空间转录组学相结合将有助于获得细胞与细胞之间信息交流的原位信息，有助于在细胞转录组学与临床影像学之间建立起桥梁，从而更好地获得时空分子影像信息和医学相关的信息。希望可以通过对循环系统中细胞分群和分化状况的研究，更好地了解肿瘤微环境中炎症细胞间进行信号交流的情况。希望通过综合分析scRNA-seq和单细胞多组学和跨组学研究结果，结合人工智能，可以对肿瘤微环境中炎症细胞状况，药物敏感性和患者预后等问题进行解析。

在未来作为临床常规生化检测手段方面，scRNA-seq 已经取得很大的进展。scRNA-seq 将有助于临床诊断的建立并指导分子医疗的进行。但是还是有许多挑战需要克服。总之scRNA-seq在多种疾病循环血细胞的分群和分化状态的研究中已经取得了很大的进展。但是所获得的试验结果在不同试验条件，技术和疾病状态下还有差异。目前已经发表的临床研究多聚焦在循环免疫细胞的研究，疾病状态下新细胞群体的检出，潜在分子机制的研究，细胞亚群之间的相互作用以及肿瘤细胞的转移等方面。但是可以明确的是scRNA-seq 极大促进了对疾病的了解，促进了疾病特异性靶点的发现以及新治疗策略的制定。只有将 scRNA-seq 进行标准化，以及将各项指标在更大临床样本中进行验证，才可以把 scRNA-seq 作为常规血液检测项目应用于临床。公共数据库信息，人工智能和计算机科技的综合应用将极大推动 scRNA-seq 的临床应用。希望本文可以引起更多科学家和临床医生对 scRNA-seq 的临床转化发现和临床应用的关注。（转化医学网360zhyx.com）

首届长三角单细胞组学技术应用论坛

为推动我国单细胞组学技术更快、更优的解决临床问题，中国医药生物技术协会基因检测技术分会、中国遗传学会遗传诊断份会、上海市临床生物信息学研究所、上海市遗传学会、长三角一体化基因检测联盟、转化医学网等多家单位共同发起“首届长三角单细胞组学技术应用论坛”，论坛将于2022年3月3日-4日在上海举办，通过分享研究热点、技术进展、应用场景、临床需求、市场反馈、瓶颈分析及机遇与挑战等话题，对单细胞组学技术做深入的交流与探讨，期待您的参与！

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参考文献：

1. IUIS-WHO Nomenclature Subcommittee. Nomenclature for clusters of differentiation (CD) of antigens defined on human leukocyte populations. IUIS-WHO Nomenclature Subcommittee. BullWorld Health Organ. 1984 ; 62 (5) : 809-815.
2. Zeng Y, Wang X, Zhang J. Single-cell biomedicine: roles of single-cell nuclear elements. Cell Biol Toxicol. 2020; 36 (1): 1-3.
3. Wilk AJ, Rustagi A, Zhao NQ, et al. A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19. Nat Med. 2020;26(7):1070-1076.
4. Schulte-Schrepping J, Reusch N, Paclik D, et al. Severe COVID-19 is marked by a dysregulated myeloid cell compartment. Cell. 2020;182(6):1419-1440.e23.
5. Tang H, Gao Y, Li Z, et al. The noncoding and coding transcriptional landscape of the peripheral immune response in patients with COVID-19. Clin Transl Med. 2020;10(6):e200.
6. Hao Fang, Yiming Zeng, Lianzhong Zhang, Chengshui Chen, Charles A. Powell, Xiangdong Wang. Can single-cell RNA sequencing reshape the clinical biochemistry of haematology? New clusters of circulating blood cells. Clinical and Translational Discovery. 2022;(2)1: https://doi.org/10.1002/ctd2.19.