数亿头猪的非洲猪瘟检测获“十四五”持续推动，近岸蛋白提供非洲猪瘟抗原、分子酶等优质诊断原料

2022年1月17日，中国动物疫病预防控制中心印发的《非洲猪瘟防控技术指南》中指出“屠宰企业要严格落实非洲猪瘟自检制度，防止阳性猪只产品流入市场环节”。

近岸蛋白响应国家政策和市场需求，自主研发生产ASFV p72活性蛋白复合物、p30蛋白、p54蛋白、pS273R蛋白、qPCR、LAMP等酶及试剂，且性能优质，满足市场需求，数据详见下文信息。

据世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，OIE）报告，2020年1月以来，已在35个国家检测到ASFV，影响了超过100万头猪和3万头野猪（数据来源INs和FURs报告），动物损失超过170万头。从下图中可以看到，在中国多个省市均有发现ASFV疫情，整体是比较严重的。

为了满足国内日益增长的非洲猪瘟监测需求，农业农村部自2019年以来一共批准了7种非洲猪瘟检测试剂新兽药。

据国家统计局公布的数据，2021年全国生猪出栏量达6.7亿头。由此可见，ASFV监测的需求是非常庞大的。2021年7月2日，中国动物疫病预防控制中心公布了通过专家评审的ASFV抗体检测试剂盒名单，具体情况见下表：

背景介绍

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪或野猪引起的一种急性、热性、高度传染性疾病。ASF原发于非洲，蜱（软蜱科中的钝缘蜱属）是其自然宿主和传播媒介，该病病程短、死亡率高，OIE将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

ASFV具有独特而复杂的五层结构，从外到内分别是外膜（Outer membrane）、衣壳（Capsid）、内膜（Inner membrane）、核壳（Core shell）以及核心（Nucleoid）。

ASFV病毒结构示意图（Sheng Liu, et al. Cell Host&Microbo，26, 836–843）

从整体上看，ASFV衣壳结构跟其他核质大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）衣壳结构较为相似，由20个三重对称壳粒聚集体（Trisymmetron）和12个五重对称壳粒聚集体（Pentasymmetron）组成。其中，每个Trisymmetron由135个壳粒（Capsomer）组成，而每个Pentasymmetron由30个壳粒和1个五邻体（Penton）组成。而常用于检测的p72蛋白（近岸蛋白可提供ASFV p72活性蛋白复合物）就是壳粒的主要组成蛋白之一。其基因组为双链闭合线性DNA分子，基因组大小为170～194 kbp，含有150～167 个开放阅读框（open reading frames，ORF），编码54 种结构蛋白和100 多种非结构蛋白。而常用于核酸检测靶基因为B646L(近岸蛋白可提供qPCR、LAMP等相关酶及试剂），此区域也作为ASFV基因分型区域。

ASFV病毒主要蛋白（图片来自于网络）

病毒复制及感染症状

ASFV 通过内吞或者胞饮作用侵染宿主细胞，其靶细胞主要是单核-巨噬细胞。利用巨胞饮泡或内吞体中低pH的环境，病毒颗粒脱去病毒囊膜，病毒内膜与内体膜融合，暴露病毒基因组。病毒DNA复制与病毒颗粒的组装发生在称为“病毒工厂”-靠近细胞核的特殊胞质区。随后病毒在细胞内组装成成熟的二十面体病毒颗粒，并在细胞中进行复制、转录和翻译。基因组和蛋白质组装完成后通过动力蛋白运输到细胞膜附近，经出芽释放到细胞外。

根据GB/T 18648-2020，将该病毒的临床表现分为最急性、急性、亚急性和慢性。具体表现如下：

（一）最急性：无明显临床症状突然死亡。

（二）急性：体温可高达42摄氏度，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发绀。眼、鼻有黏液脓性分泌物；呕吐；便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；腹泻，粪便带血。共济失调或步态僵直，呼吸困难，病程延长则出现瘫痪、抽搐等其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100% 。病程4至10天。

（三）亚急性：症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低。体温波动无规律，一般高于40.5摄氏度。仔猪病死率较高。病程5至30天。

（四）慢性：波状热，呼吸困难，湿咳。消瘦或发育迟缓，体弱，毛色暗淡。关节肿胀，皮肤溃疡。死亡率低。病程2至15个月。

疫苗研发

迄今为止ASFV疫苗研发进展缓慢，ASFV的复杂性是疫苗研制延迟的一个主要因素。

灭活疫苗迄今尚未成功，可能是因为病毒颗粒有两种感染形式，即细胞外和细胞内成熟，而中和抗体不能完全抑制这些不同病毒的感染。病毒蛋白p72、p54和p30是已知的中和抗体靶点。

减毒活疫苗可诱导高达100%的免疫保护,但是其安全性是个问题，此类疫苗上市仍需要数年时间。

基于单个或多个基因或蛋白制作的ASFV亚单位疫苗可能比减毒活疫苗更安全。

抗病毒药

ASFV具有许多复制所需的特异性酶类，包括RNA和DNA聚合酶，这些酶应该是抗病毒药物开发的良好特异靶点。有几种化合物已被证明在细胞培养中抑制了ASFV的复制，但到目前为止还没有在猪身上进行过试验，目前暂无上市药物。

因为缺乏疫苗以及特效药，目前控制ASF必须依赖于检疫和屠宰政策以及快速检测。这也是国家和各省市接连出台相关防控政策的重要原因。

常见检测方法

根据GB/T 18648-2020，目前该病毒检测主要分为核酸检测、抗体检测、抗原检测三大类。

抗体检测：是指用抗原检测感染样本中ASFV抗体的方法。ASFV抗体在感染早期（7-10天）就可被检测到，并且会存在数年甚至终生。而ASFV抗体阳性，是机体感染该病毒的最直接证据。GB/T 18648-2020中详细的介绍了ELISA间接、阻断（竞争）、夹心等方法的步骤及结果判读。该方法适用于亚急性、慢性、及大规模血清筛查，但不适用于急性病例（因检测到抗体时，猪可能已经死亡）。目前，用于抗体检测的抗原主要包括p30、p54、p72等蛋白（近岸蛋白可提供非洲猪瘟抗体检测所需p72、p30、p54抗原产品）。如INGENASA基于p72特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒，SVANOVIR 基于p30蛋白的间接ELISA检测试剂盒等。

近岸蛋白提供真核细胞表达的ASFV p72活性蛋白复合物，纯度大于95%，灵敏度高，已经大规模生产，客户认可度高。该蛋白经ELISA方法验证，具有较高的灵敏度，优于竞争公司。

通过检测ASFV阴性及阳性样本及其他疾病样本，显示近岸蛋白ASFV p72蛋白阴阳性符合率高，且特异性好，优于竞争公司。

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核酸检测：是指使用核酸扩增法检测感染样本中ASFV目标基因的方法。已获批的核酸检测试剂盒，主要采用qPCR法和荧光恒温扩增法两种（近岸蛋白可提供qPCR、LAMP等相关酶及试剂）。目前，qPCR检测是该病毒检测的“金标准”，其灵敏度及特异性好，并且设计了防污染系统避免了假阳性问题。qPCR法大多基于ASFV B646L基因的高度保守区设计。也有根据E183L基因、CP530R 基因、CSFV 5'UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因设计引物和探针。qPCR法检测的灵敏度可比普通PCR法高10~1000倍，已广泛应于ASFV的检测，可以在1h内完成检测。也有部分试剂盒不用核酸提取，直接扩增，但对样品类型要求较高，敏感性也受影响。目前由国家出台的GB/T 18648-2020中所描述的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法在我国非洲猪瘟病毒检测中发挥重要作用。

近岸蛋白提供高灵敏度、高稳定性qPCR检测酶及试剂，适用于不同核酸提取方式获取的样本检测，并具备超强防污染性能，有效防止假阳性。

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同时，为进一步提高ASFV检测效率，越来越多的试剂盒开发商倾向于核酸免提取方式，一方面进一步压缩检测时间，另一方面减少核酸提取成本。

为满足该部分应用，近岸蛋白特开发血液直扩型qPCR检测试剂，经ASFV核酸检测验证，可耐受整个检测体系中20-30%的全血含量，抗抑制性能强，并可进行四重基因扩增。

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虽然qPCR方法检测灵敏度高，但受限于仪器设备和实验条件，不能做到实地检测，对于大多数检测条件有限的养殖户来说成本较高。LAMP等温扩增法解决了该类限制，为基层实验室提供了一种选择。LAMP利用Bst DNA聚合酶，在恒温水浴锅等简易设备中即可完成检测，并可用肉眼观测结果。LAMP优势是快速、灵敏，可以在30min内完成检测，操作简单，不需要特殊的仪器设备，在基层如屠宰场、养殖场具备广阔的应用前景。

近岸蛋白提供基于BST 2.0 DNA聚合酶设计的核酸检测试剂，灵敏度高，搭配逆转录酶可进行RNA样本的检测。

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抗原检测：是指采用抗体检测ASFV抗原的方法。ASFV抗原检测目前最常用的方法是夹心ELISA抗原检测。ASFV的p30蛋白由CP204L基因编码，具有很强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到。GB/T 18648-2020中详细描述了采用p30蛋白单克隆抗体检测相应的抗原。虽然该方法灵敏度低于“金标准”，存在假阴性的缺陷，但是因为其成本比PCR更为低廉且可在没有特殊实验室仪器的设备下操作，可作为急性病例或者大规模的样本筛查辅助方法。基于抗体开发的胶体金免疫层析法，操作简单、快速，可以10min内完成检测，不需要仪器读数。但该方法的灵敏度较差，可能会存在假阴性结果。由于其局限性，当前仅适用于病死猪的ASFV检测。截止目前有研究以检测p72蛋白建立胶体金法。同样基于侧向层析的荧光免疫技术，灵敏度比胶体金提高了约100倍，操作比ELISA更简便。该方法内含有大量荧光报告分子，荧光信号强而稳定，不受溶剂的影响，具有极强的抗光漂白能力，采用手持式荧光仪读取数值，人为因素影响小。

当前，我国在非洲猪瘟防控方面取得了积极的成效，但是过往疫情已经在我国形成较大的污染面积，仍然有爆发疫情的可能。我们必须加强疫病监测和实验室检测，控制传染源，切断传播途径，保护易感动物等相关措施，才能更好地防控疫情。

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苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，是一家专注于重组蛋白应用解决方案的高新技术企业，主营业务为靶点及细胞因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售，并提供相关技术服务。公司定位为医疗健康与生命科学领域原料与技术解决方案的上游供应商，致力于为下游客户提供及时、稳定、优质的产品及服务，助力全球生物医药企业和研究机构的技术与产品创新升级。

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