首创! 单管反应同时检测21/18/13三体的数字PCR无创产前检测（dPCR-NIPT）可取代血清学筛查

2022 年06 月，Journal of Translational Medicine（影响因子5.531）杂志发表题为“A dPCR-NIPT Assay for Detections of Trisomies 21, 18 and 13 in a Single-tube Reaction-Could It Replace Serum Biochemical Tests as a Primary Maternal Plasma Screening Tool?”（单管反应同时检测21、18 和13-三体的数字PCR 无创产前检测（dPCR-NIPT），可否取代血清学筛查作为孕妇血浆初筛工具？）的文章，本研究由深圳（上海）塔歌生物技术有限公司，郑大一附院遗传与产前诊断中心，上海小海龟科技有限公司，和河南新柏恩医疗科技有限公司合作完成。染色体疾病是危害性较大的新生儿出生缺陷疾病之一，如21-三体综合（T21）、18-三体综合征（T18）和13-三体综合征（T13）。我国每年唐氏儿出生数约为2.3~2.5例，并随着孕妇高龄化、生活环境及食品安全恶化、开放生育政策等因素呈上升趋势。至今，染色体疾病尚无有效的治疗方法，主要依赖产前筛查与诊断进行预防。目前，T21、T18和T13产前筛查方法有：血清学筛查和二代测序无创产前筛查（NGS-NIPT）两种方法。血清学筛查具有检测便利和成本低的优点，但阳性检出率低(60%-80%) 和假阳性率较高（血清学筛查出来的阳性样本中，大于90%都是假阳性）。NGS-NIPT具有阳性检出率高（97%-99%）的优势，但检测周期长、技术门槛高、检测费用昂贵。针对上述两个现有筛查方法的不足，塔歌生物成功开发出了同时具备高阳性检出率和低检测成本的dPCR-NIPT试剂盒，这是世界上首次报道在真实临床条件下通过盲检实现一管反应可从孕妇血浆样本中同时检测出T21、T18和T13的数字PCR无创产前筛查试剂盒。该文章主要内容：

一、塔歌dPCR-NIPT试剂盒的性能优势：

二、塔歌dPCR-NIPT试剂盒的临床样本检测数据：

1) 为了能够一管反应同时检查T21，T18和T13，塔歌独创性地设计了第21、18和13 号染色体（Chr21、Chr18 和Chr13）各自同时作为目标检测染色体及互为参考染色体的检测方法（图5）；

2) 检测仪器：上海小海龟科技有限公司的BioDigital·青数字PCR系统

上海小海龟科技有限公司的BioDigital·青数字PCR系统，采用独创的玻璃基底高性能微流控芯片实现数字PCR精准定量，具备如下特点：

1. 操作简单：全封闭自动化液滴制备，上样、制备无人工操作；
2. 耗材成本低廉：自动化GMP芯片、试剂生产产线；
3. 高通量：1~96样；4~5色荧光通道；
4. 液滴数量：>2万，有效液滴比例：95%以上；
5. 试剂开放：支持第三方qPCR试剂盒转移到dPCR平台；
6. 结果精准稳定：均一的分区，符合泊松分布计算，比普通油包水更精准、稳定；
7. 及时的售后响应：技术支持，应用开发
   
   

3) 测定染色体拷贝数和计算拷贝数比值：通过数字PCR测定样本中Chr21，Chr18和Chr13 的拷贝数（dPCR 系统软件自动给出各拷贝数比值），然后计算Chr21/Chr18, Chr21/Chr13和Chr18/Chr13的拷贝数比值；

4) 计算样本中各拷贝数比值的Z值：根据下列公式，

其中, “ZChrT/ChrR”是待检样本的拷贝数比值的Z值，“Sample RChrT/ChrR”是待检样本的拷贝数比值，“BL Mean RChrT/ChrR ”是正常孕妇人群的相应的拷贝数比值均值（作为基线），“SD of BL Mean RChrT/ChrR ”是正常孕妇人群的相应的拷贝数比值均值的标准误差。

5) 根据本研究使用的小海龟dPCR 系统的液滴数量（约20000 个液滴/反应），我们将95%检测置信度的Z值截断值（Cut-off）定为1.65，并自创了待检样本是否为非整倍体的算法（表4）。

2. 临床样本检测结果：

1) 临床样本信息：本研究以盲检方式检测了283例 (含25例T21, 10例T18和1例T13) 高危临床样本，图1总结了这些样本的妇女年龄，孕周和产检方法等信息。

4) 直接比较dPCR-NIPT和血清学筛查结果：283例样本中，有111例样本（含9例T21 和1 例T18）同时被血清学和dPCR-NIPT 检测，直接比较这两种方法的筛查结果显示：血清学的检测灵敏度和特异性分别为80% (8/10) 和0%(0/101)，而dPCR-NIPT 的检测灵敏度和特异性分别为100% (10/10) 和97%(98/101)。数据展示了dPCR-NIPT筛查方法的灵敏度和特异性均显著优于血清学筛查方法。

因低成本的血清学筛查灵敏度低，而高灵敏度的NGS-NIPT 筛查成本太高，许多国家（包括中国）都采取了应急筛查策略 (contingent strategy, CS)，即先用低成本的血清学在降低截断值条件下（从1/270降到1/1000）对孕妇样本进行初筛，初筛阳性样本再用NGS-NIPT方法复筛。虽然降低截断值可以适当提高血清学的阳性检出率（88.9-94.2%），但同时也极大地增加了其假阳性率（从约5%增加到11.6-17.8%）。因此，现有CS（existing CS）依然面临阳性检出率偏低（因为所有的阳性样本都是用血清学方筛查出来的）和假阳性率更高（降低截断值所致）的短板。本研究在世界上首次提出了升级版CS（upgraded CS）的概念，即用dPCR-NIPT取代血清学作为初筛方法。因为dPCR-NIPT的灵敏度和特异性均显著高于血清学, 升级版CS 将极大地提高筛查灵敏度并显著地降低需要复筛的样本数。本研究以模拟案例直接比较了三种筛查方法（现有CS，直接NGS-NIPT筛查, 和升级版CS）的成本效益, 按照10000例样本来算, 升级版CS比现有CS和直接NGS-NIPT筛查可分别节省107,980美元 (7.8%) 和4,422,980美元 (77.6%)（表7）。

dPCR-NIPT具备血清学筛查的便利及低成本和NIPT的高阳性检出率的优点，可替代血清学检测方法，成为NGS-NIPT 筛查之前的新筛查技术，填补了dPCR 技术在胎儿染色体非整倍体筛查临床应用上的技术空白，为实现降低出生缺陷和临床筛查费用以及在中国部分地区开展免费产前筛查民生实事项目提供可靠的技术支持。