一种表征肺癌转移中上皮细胞——间充质转化的多组学方法

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图1 研究转移性癌症 EMT 过程中的复杂细胞形态变化

上皮细胞-间充质转化 (EMT) 是一种复杂的细胞过程，癌细胞在该过程中失去顶端-基底极性和细胞间粘附性（两者为上皮细胞的特征），并获得间充质细胞的特性（图 1a）。获得全新活动能力的间充质细胞能从原发肿瘤部位迁移，通过循环血液扩散到继发部位（图 1b）。这一过程称为转移。一旦细胞到达继发部位，该转化过程将发生逆转，间充质细胞会恢复为上皮细胞。转移的细胞开始繁殖，最终形成另一个肿瘤。已知在 EMT 过程中会发生许多表观遗传、转录组学和基因组变化。

图2 使用 TGF-β 处理人肺癌细胞诱导 EMT

我们在 T75 培养瓶中培养人 HCC827 肺腺癌细胞，并用转化生长因子 β (TGF-β) 诱导这些细胞发生 EMT。间充质表型在几天内完全发展出来，其特征为镜下可见细胞形态发生物理变化。转化后，我们采集了细胞并提取 DNA 或 RNA（图 2）。然后，我们按照多种实验方法制备了不同类型的文库，包括全基因组、转录组学和 Pore-C。我们生成了多个数据集并进行了多组学分析，以尽可能完整地了解 EMT 过程。

图3 差异性表达、异构体和染色质分析显示标志基因的变化

我们使用 DESeq2 对对照组和处理组烧瓶中的基因进行了差异表达分析，以识别间充质细胞标志物。这些标志物包括波形蛋白 (VIM)、E-钙粘着蛋白 (CDH1)、N-钙粘着蛋白 (CDH2) 和锌指 E-box结合同源异型盒 2 (ZEB2)（图 3a）。我们使用 Pore-C 观察到 CDH2 的差异性染色质环结构（图3b），表明在钙粘着蛋白转换期间发生了染色质重组。我们的差异转录本使用分析显示，处理组样本中 CD44 的一个特定异构体出现上调，但如果观察所有异构体，会发现 CD44 没有差异表达（图 3c 和 3d）。CD44 是一种细胞表面粘附分子，已知有与肿瘤转移相关的选择性剪接转录本。

图4 自适应采样显示 EMT 位点的靶向甲基化变化

我们使用定制的甲基化靶向组合进行自适应采样，来研究差异表达基因所对应基因组位点处的甲基化差异。我们在每个基因的上游和下游各添加了一个 10 kb 缓冲区，以包含启动子和附近的调控区。靶向区域用横跨图谱的蓝色条带表示（图 4a）。我们使用 DSS 和 bsseq，识别了 6 天后（染色体左侧的紫色三角形）或 16 天后（右侧的橙色三角形）对照组和处理组之间的差异甲基化区域。6 天后发现了 53 个差异性甲基化位点，16 天后发现了 127 个差异性甲基化区域。在处理期间，6 号染色体上一个组蛋白簇的甲基化发生了上调（图 4b）。