新型基因筛选方法，应对抗生素相关肠道疾病

艰难梭菌感染 （CDI） 是抗生素相关肠道疾病的主要原因，可导致严重腹泻和致命的伪膜性结肠炎。TcdB是这种细菌分泌的基本毒力因子之一，通过一种知之甚少的机制诱导宿主细胞凋亡。

根据美国疾病预防控制中心最近的统计数据，艰难梭菌在2017年造成了约230,000例病例，其中12,800例死亡，导致约1亿美元的治疗费用。作为一个全球性的医疗保健问题，迫切需要了解感染机制并开发有效的CDI疗法。

抗生素耐药菌

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艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种抗生素耐药菌，在使用抗生素，尤其是过量使用抗生素时，很容易出现艰难梭菌感染（CDI）。通常，艰难梭菌通过口腔进入人体内并保持休眠状态，直到在大肠中感染并释放毒素，破坏组织。这些毒素会杀死细胞，从而导致腹泻、腹痛、发烧，在极端情况下会致命。

艰难梭菌感染主要由两种外毒素介导，艰难梭菌毒素A和B（TcdA和TcdB）。这两种毒素对细胞都有细胞毒性，但TcdB会导致更多的细胞死亡并导致严重疾病。专注于TcdB，许多研究表明，TcdB使用多步骤策略来陶醉宿主细胞。通过与宿主肠表面的受体结合进入细胞，然后通过受体介导的内吞作用内化。TcdB可以同时使用多种受体或具有针对不同细胞类型的特异性受体。细胞毒性攻击可能破坏肠上皮屏障，导致肠腔积液，组织损伤和严重炎症。首次报道了连接板珠蛋白（JUP），γ-连环蛋白在上皮细胞凋亡中的重要作用以及抑制高迁移率组框1（HMGB1）用于CDI治疗的潜力。

新型基因筛查法

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该项研究的成员之一、昆山杜克大学自然与应用科学部生物实验室讲师李迎雪博士对实验过程进行介绍：“我们开创了一种新型基因筛查法，利用细菌细胞制造了数千个精确基因靶向的RNA分子，即小干扰RNA(siRNA)。然后我们使用高通量方法去测试这些siRNA，并使用生化检测和显微镜观察的方式，去了解在艰难梭菌毒素诱导下siRNA在细胞死亡中所发挥的作用。最后，我们初步筛选出最有可能的候选基因，再通过各种实验室技术验证它们是否在艰难梭菌毒素诱导的细胞损伤中产生了效果。”该方法的好处在于可以降低成本，简单、便宜地生产高效的小干扰RNA。

使用新的RNAi筛选方法鉴定参与TcdB诱导的凋亡细胞死亡的宿主因子。选择Caco-2细胞作为结肠上皮的模型，结肠上皮对TcdB诱导的细胞凋亡高度敏感。创建了一个细菌产生的RNAi文库，基于pro-siRNA技术定制为Caco-2细胞，并使用半胱天冬酶3/7和细胞活力测定作为RNAi筛选的读数。筛选揭示了参与TcdB诱导细胞凋亡的多种宿主因子。

为了确定HMGB1是否也参与TcdB诱导和线粒体介导的细胞凋亡，研究人员在转染了靶向HMGB1（siHMGB1-1）的siRNA的Caco-2细胞中进行了相同的细胞色素c释放测定。HMGB1在转染siHMGB1-1的细胞中的表达几乎完全抑制。这些数据表明JUP和HMGB1都参与TcdB诱导和线粒体依赖性凋亡途径。HMGB1在TcdB诱导的细胞凋亡中起着至关重要的作用，并可作为治疗CDI的潜在治疗靶点。

成熟的抑制剂

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甘草甜素（也称为甘草酸）作为HMGB1的成熟抑制剂，用于确定甘草甜素治疗是否可以缓解TcdB诱导的细胞凋亡。甘草甜素是从甘草植物的根中提取的植物糖苷。它有两种异构体：18β-甘草甜素和18α-甘草甜素，通过异构化衍生自18β-甘草甜素。注射液以甘草甜素为主要活性成分，甘氨酸和半胱氨酸盐酸盐为附加成分，以提高药物的稳定性、溶解性和安全性。这项研究使用纯化的甘草甜素和CGI来评估它们对TcdB的保护作用。

细胞系和动物实验都表明，甘草甜素预处理可以保护结肠上皮免受TcdB诱导的损伤。甘草甜素预处理显著降低了TcdB诱导的细胞舍入和细胞死亡。这些发现支持HMGB1作为潜在的药物靶标，使用HMGB1抑制剂甘草甜素的批准药物治疗CDI。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://doi.org/10.1128/mbio.01849-22

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。