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腾讯登录【推荐】从血液检测到液体活检：迈迪安在推动肿瘤精准医疗方面的最新进展
| 导读 | 迈迪安在推动ctDNA液体活检的高灵敏度qPCR检测！ |
几年前的哈佛医学院附属丹娜-法伯癌症研究所(Dana-Farber cancer Institute)和梅奥诊所(Mayo Clinic)的研究团队曾显示通过一管血液可以筛查50多种癌症，以及它们在体内的位置，准确度相当到高(1)。
通过液体活检的早期癌症筛查增加了癌种患者成功治疗的可能性，例如仅需采集患者5-10mL血液，通过检测血液中循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA （ctDNA）或外泌体的数量、遗传特性等信息，即可覆盖癌症诊断与治疗的全部领域，同时，克服常规肿瘤标志物（主要是蛋白质或糖蛋白）的局限性。
全球已经达成共识，通过血液检测的液体活检技术帮助肿瘤患者的诊断和治疗将是肿瘤精准医疗中的‘game changer’。
目前用于血液液体活检的方法是NGS和PCR。NGS在高通量多癌种筛查和对未知位点的检测上较具有优势，而PCR在对灵敏度要求较高的检测和成本上较具有优势，尤其对于MRD和已知位点的检测，更利于对治疗效果的监测。
其中一些癌症标志物，包括 CTCs、ctDNA和RNA (mRNA和microRNA)，可以通过使用超灵敏技术的分子检测来检测。
例如，一个特定的单核苷酸多态性(SNP)的存在或不存在可以影响癌症患者的预后。
同样，肿瘤抑制基因的超甲基化也可以帮助证实或者否定诊断。
个体基因型可导致某些类型的肿瘤和易感性影响其他治疗的结果，如CYP3A4类固醇羟化酶可能通过调节性激素代谢物水平参与乳腺癌和前列腺癌的致病过程。
存在于血液样本中或者是提取核酸过程中残留的抑制物都可以影响液体活检的PCR相关检测，同时血液中存在的ctDNA和cfDNA含量较低对于检测的灵敏度和特异性也是重大挑战。
迈迪安液体活检血液qPCR检测
迈迪安通过多项研究，近日在Tri-Con展会上分享了创新开发的Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液(MDX092)和 Lyo-Ready™可冻干血液直扩基因分型qPCR预混液(MDX128)用于液体活检中高灵敏和高特异的SNP的鉴别和甲基化水平的准确检测。
01 SNP-特异性&多重检测
使用MDX092对突变型表皮生长因子受体(EGFR)进行检测，样本中同时存在大量竞争性的野生型EGFR。图1是对外显子21号 SNP (L858R)的扩增，野生型样本来自合成模板和人体gDNA的等量混合。
图1.MDX092 - SNP检测特异性
对10%血浆样本中的三个靶标：EGFR基因21号外显子L858R突变型、EGFR基因20号外显子T790M突变型（具耐药性）和19号外显子缺失突变型三个靶标进行多重扩增，结果显示三个靶标的检测LOD均为10个拷贝，说明检测的灵敏度和特异性均未受样本中抑制物的影响。
此外，在25%的血浆中也可以检测出10个拷贝的 T790M突变型(图2)。
图2.血浆样本的多重检测。在10%的血浆中直接扩增出三个10拷贝的EGFR突变靶标，其中突变T790M的检测Ct值在有25%血浆存在的情况下几乎无变化。
02 SNP-等位基因区分
通过对CYP3A4等位基因鉴别检测来评估 MDX128在有2mM血红素（一种溶血样本中常见的抑制物）存在的情况下的抗抑性，同时与对比试剂T & K进行比较。
结果显示，Lyo-Ready™可冻干血液直扩基因分型qPCR预混液能更准确对等位基因进行，在比正常生理浓度高出100倍的血红素存在的情况下比另外两个对比试剂的集群分别率更高，说明MDX128具有更大的抑制剂耐受性。
图3 使用MDX128对含有2mM血红素的等位基因的鉴别。蓝色:VIC荧光纯合DNA (C等位基因)。绿色:杂合子(A / C)。红色:FAM荧光纯合子(A等位基因)。黑色:NTC。在同一反应条件下与对比试剂T和K进行比较。
图4使用MDX12对10%全血和20%血浆中的等位基因的鉴别。蓝色:VIC荧光纯合DNA (C等位基因)。绿色:杂合子(A / C)。红色:FAM荧光纯合子(A等位基因)。黑色:NTC。
对10%全血和20%血浆中的等位基因检测也有类似的结果，也证明了适合于POC检测直接进行对液体活检的样本中检测。
03 甲基化检测-亚硫酸氢盐处理的样本
经过对提从血液中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理后，对一组不同程度（1%、2%、5%和10%）的人体甲基化DNA样本进行检测，使用MDX092进行qPCR检测以对其区分不同甲基化水平能力的灵敏度进行评估。
*brcal qPCR检测是专门针对brcal 启动子区域甲基化的亚硫酸氢盐转换序列的扩增(2)。
使用MDX092分别为2000,200和20个拷贝的人体基因组样本进行brcal qPCR扩增, 扩增曲线可以清楚地区分1-10%甲基化(图5)。
与对比试剂Q相比，MDX092的可检测模板浓度低5个数量级(图6)。
图5. brca1的甲基化水平区分。MDX092可以明确区分1%，2%，5%和10%甲基化，并且可以检测低至1拷贝 (e.g. 从20个拷贝中模板检测出5%甲基化DNA)。
图6.与专用甲基化检测的预混液Q进行性能比较。
04 甲基化检测-MSRE处理样本
使用甲基化依赖酶(仅切割甲基化DNA)或甲基化敏感酶(仅切割未甲基化的DNA)也可作为亚硫酸氢盐处理的替代方法以确定甲基化水平。
从血液中提取的DNA样本在简单的经过消化酶处理后经过热失活步骤，甲基化使用MDX092进行扩增,以区分与亚硫酸氢盐处理相同的低水平甲基化靶标(brca1)(图7)。
图7.MDX092-MSRE检测。人体gDNA经过Lpn I和Ssi I (Aci I)限制消化处理后在80℃热灭活20 min，取5 μl直接加入20 μl qPCR反应进行brcal qPCR检测。
05 最大化灵敏度-低至1个拷贝DNA
使用风干后的MDX092可以最大化提高加样量，从而提高灵敏度，可以检测到EGFR19外显子缺失的单个拷贝(图8)。
图8.MDX092 -灵敏度和样本量的比较。血浆样本中加入EGFR19号外显9缺失的合成模板。使用对比试剂K检测的液体体系中最大加样量为反应体积的45%，而使用风干后的MDX092，可以使用100%的血浆进行复溶。
总结 CONCLUSION
迈迪安研发的专门针对血液样本的抗抑性qPCR预混液是液体活检的最新解决方案，非常适合从提取的核酸样品或直接从液体活检样本中进行分子检测。
该技术不仅可以降低检测的成本和复杂性，同时能够灵敏地检测出低量的癌症标志物。
其优化的配方在SNP检测和等位基因识别中表现出最大的特异性和扩增效率，并且能从亚硫酸盐处理的DNA或直接从MSRE限制消化中区分出1%和2%的甲基化。
这些创新的qPCR预混液可兼容冻干和风干的形式，因此适用于高通量的筛查，或是患者更容易进行的床旁POC检测，为癌症早期诊断和治疗检测的液体活检血液检测发展提供了强大的工具。
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参考信息：
（1）https://grail.com/clinical-studies/pathfinder-study/
（2）https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23623832/
END
北京迈迪安生物科技有限公司是Meridian Bioscience在中国设立的全资子公司。Meridian BioScience （以下简称：迈迪安）是一家全球领先的生物诊断公司，总部设立在美国，距今已有45年的历史。迈迪安公司分为诊断和生命科学两个部分，在中国地区的主营业务是生命科学产品，包括各种分子和免疫诊断检测的关键原料，如抗原抗体、免疫阻断剂、PCR和LAMP反应的聚合酶和优化的预混液、核苷酸等，为人体、动物、农业、环境及食品安全等各种检测提供全面的解决方案。45年来，迈迪安已经成为全球各领域诊断企业的首选原料供应商！
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