未发先火！美国国家癌症研究所首试Duomic技术——转录组+蛋白组“一步”到位

单细胞测序数据，鱼也；

单细胞功能蛋白组学数据，熊掌也。

鱼与熊掌能否兼得呢？

请注意这里的兼得不是指用同一批细胞中的一部分去测序，另一部分进行蛋白组学研究，而是同时得到同一个细胞中的单细胞水平的蛋白组层面和核酸层面的数据。要想做到这一点需要依靠Phenomex公司旗下品牌IsoPlexis推出的Duomic平台解决方案，该平台整合了单细胞分泌组和单细胞转录组的检测功能，做到了将一个细胞中核酸和蛋白数据建立联系，进行综合分析。

2023年3月美国国家癌症研究所的Mitchell Ho实验室，在《Nature Communications》（IF= 17.694）发表题为“The IgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves VHH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer.”的一篇文章使用的Duomic平台完成了CAR-T细胞相关的评估和研究(图1)。

图1：Duomic检测过程

CAR-T疗法在对抗癌症方面是革命性的，但目前FDA批准的疗法适用性较窄，主要是针对B细胞恶性肿瘤的CD19-CAR。不幸的是，这些人中只有约50%的人在长期内保持了对治疗持续的应答。其中一个原因是靶细胞呈递肿瘤抗原，如B细胞癌，不再表达CD19，使CD19-CAR无效。CAR功效的另一个影响因素是受体和抗原之间的物理间距。

为了应对胰腺癌治疗的同类问题，研究团队开发了靶向Glypican-1（GPC1）的CAR产品，GPC1是一种在许多胰腺癌中高表达的表面蛋白。研究团队分别开发了以单峰驼VHH纳米抗体的产生（D4）和单克隆抗体（HM2）为基础的靶向GPC1的CAR-T细胞。这两种CAR都靶向GPC1，HM2-CAR和D4-CAR分别靶向GPC1膜近端和膜远端的表位。在细胞培养和小鼠模型中，他们发现他们的CAR产品可以促进有效的肿瘤杀灭和整体持久性。D4-CAR产品在他们的模型中具有更高的转导效率和肿瘤清除率，与HM2-CAR相比，研究小组更关注D4-CAR产品。

虽然这些结果表明它们的CAR产物对表达GPC1的肿瘤有效，但它们对低表达GPC1的细胞杀伤效果不够好，这表明它们的CAR有改进的空间。先前的研究已经指出CAR间隔区的长度优化与其靶向的目标表位位置有关。因此，该小组开发了间隔区短、中、长的D4-CAR。对比了多种设计的CAR-T细胞，短D4-CAR（D4-IgG4H- CD28TM-CAR）表现出最大的细胞毒性。小鼠模型中进行了肿瘤杀伤试验，证实D4-IgG4H-CD28TM-CAR在他们的模型中对减少肿瘤体积最有效，即使对GPC1低表达的胰腺癌也是如此。最近的研究表明，在单细胞水平上确定的多功能的T细胞（同时分泌 2种或更多的细胞因子）是促成长期免疫应答的关键效应细胞，作用与各种疾病的长期免疫反应。研究者使用PhenomeX旗下IsoPlexis品牌的Duomic技术检测了细胞的多功能性及细胞功能与转录组之间的关系。

研究者将CD4+或CD8+ D4-IgG4H-CD28TM-CAR-T细胞与肿瘤靶细胞T3M4或GPC1 KO T3M4细胞以1：2的比例共培养20小时，并将CAR-T细胞加载到小鼠适应性免疫IsoCode芯片，分析多功能细胞，即分泌两种及两种以上因子的细胞，得到细胞多功能性相关的数据细胞多功能指数PSI(图2)。可以看到，细胞分泌的主要因子(超过2%细胞分泌的因子)为Granzyme B 和IP-10，只有D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞的CD4+和CD8+ T细胞亚群的多功能性显著增强；且与GPC1 KO T3M4细胞相比，用T3M4细胞刺激时，PSI明显增加。

图2：细胞多功能指数PSI的组间对比

图4：多功能性不同亚群间蛋白分泌组差异

蛋白分泌组差异深层次的原因来自于基因层面，尤其是转录组的差异，单细胞mRNA结果显示23个基因在多功能性强的细胞亚群与多功能性弱的细胞亚群之间有显著的统计学差异。基因涉及44种通路，多功能性强的细胞亚群中上调的基因涉及细胞增殖(e.g., ID1)、细胞因子信号传导(e.g., ISG20)和免疫反应(e.g., HMGB1)等功能，这些功能与CAR-T疗效有直接的关系(图5)。相反，多功能性弱的细胞亚群中的上调基因(e.g., INPP5D)可能对免疫反应或细胞因子信号传导产生负面影响。

图5：两个亚群间基因层面的差异

图6：REACTOME通路分析

总之， D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞被证明有着显著优于其它设计的包括细胞多功能性、细胞因子、PSI指数、基因层面等诸多特性。CAR-T细胞的单细胞蛋白质组和转录组分析揭示了与T细胞多功能性增强相关的特定基因(如HMGB1）。这项研究证明了基于VHH的CAR-T治疗胰腺癌的潜力，并提供了一个开发有效CAR-T的工程策略。

在研究中PhenomeX的IsoCode Duomic技术和细胞多功能指数等指标起到了重要的作用，包括：

− 直接表征细胞功能

− 潜在的生物标志物PSI可以与临床结果建立相关性，其它的体外实验技术难以做到这一点。这就使单细胞蛋白组学可以应用在临床转化的全流程研究中，包括从基础研究开始的，为靶标评估、设计、筛选提供一种标准性的技术

− Duomic技术平台的出现，使细胞功能研究在单细胞功能蛋白组的基础上更深入了一步，使得蛋白与核酸的数据“直接”联系起来，这种直接指的是在单细胞水平上看同一个细胞分泌的蛋白及该细胞的转录组表达的关系。

Duomic技术的出现能够加快先进医学的转化和迭代！

关于PhenomeX

PhenomeX（NASDAQ: CELL）致力于助力科学家充分探索每个细胞的潜能，推动功能细胞生物学迈向新纪元，以促进人类健康发展。我们为科学家提供揭示细胞功能的完整见解，使其全面了解每个细胞的深度功能表征。我们经过验证的独特高通量工具和服务提供了无与伦比的解决方案，加速了多功能细胞研究发展，成为改善疾病预防和治疗的关键。我们屡获殊荣的平台已获得全球各地研究人员的高度认可，包括全球前15家制药公司的研究人员，以及约85%的美国领先综合性癌症中心的科研人员。

PhenomeX家族的单细胞功能表征平台（原Berkeley Lights）Beacon®基于其特有的光电定位技术 (OptoElectro Positioning, OEP™) 为广大科学家提供了先进的研究手段，对数以万计单细胞的基因信息、功能等进行深入表征，以筛选出满足用户需求的目的细胞。Beacon®应用场景涵盖抗体发现、细胞株开发、传染病研究、免疫学研究、肿瘤生物学研究、细胞疗法开发、基因编辑、农业科学等多个领域，为从事尖端的科研项目及加速企业生物产品的开发提供了前所未有的机遇。

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