【CELL DEATH DIS】中国药科大学研究发现可显著抑制肝癌转移的抑制剂

近来，单细胞极性被证明是某些肿瘤细胞在液相状态下的先天特征，并直接参与细胞对血管的粘附和肿瘤的转移。在此，我们描述了悬浮培养中HCC细胞维持的sc极性，并研究了其在转移过程中的作用和调节机制。我们证明瞬时受体电位香草蛋白4 (TRPV4)是通过激活Ca2+依赖性AMPK/MLC/ERM途径来促进sc极性的调节剂。这减弱了转移性HCC细胞对血管内皮细胞的粘附。抑制TRPV4可以减少肿瘤转移，不仅影响肿瘤细胞的迁移和侵袭，还可以阻止肿瘤细胞粘附血管内皮细胞。此外，我们发现了一种全新的TRPV4抑制剂GL-V9，它可以改变sc极化的程度，显著降低HCC细胞的转移能力。

https://www.nature.com/articles/s41419-023-05903-z

研究背景

01

肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因。目前，尽管HCC治疗取得了重大进展，但转移仍然是成功治疗的主要障碍。转移是一个复杂的、多步骤的生物学过程，涉及多个基因和生物分子。在循环系统中，转移性肿瘤细胞具有逃避免疫监视、适应血流剪切力、维持非锚定生长的能力。因此，了解癌细胞转移的分子调控将有助于肝癌治疗中有效药物靶点的新发现。

单细胞极性是指单个细胞在液相中表现出的一种细胞极性。Sc极性的特征是ezrin、radixin和moesin (ERM, E为ezrin, R为radixin, M为moesin)蛋白和F-actin蛋白在细胞皮层积聚，形成点状或帽状结构。支架蛋白ERM负责将f -肌动蛋白连接到质膜上。sc极性的形成依赖于ERM蛋白的磷酸化，该磷酸化打开n端4.1-ezrin-radixin-moesin (FERM)结构域并暴露F-actin结合位点，协调细胞骨架与膜结构形成特殊的细胞皮层。据报道，某些类型的肿瘤细胞，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤和胃癌，可以维持sc极性，并通过影响其与血管的粘附和转运来促进肿瘤转移。F-actin的极性积累与β1-整合素、黑色素瘤细胞粘附分子(melanoma cell adhesion molecule, MCAM)和细胞间粘附分子-1共定位，可能有助于提高肿瘤细胞的粘附性。

肌球蛋白轻链(Myosin light chain, MLC)磷酸化对许多细胞过程至关重要，包括局灶黏附、运动和细胞形态发生。研究证明，MLC的磷酸化对于MCAM(黑色素瘤细胞粘附分子)诱导sc极性的能力至关重要。然而，其在转移和肿瘤sc极化控制中的意义仍不清楚。

致癌钙信号是驱动肿瘤侵袭-转移级联及其转化潜能的关键。瞬时受体电位香草蛋白4 (transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是TRP家族的一员，是一种钙渗透性非选择性阳离子通道，有助于多种器官的生长和结构完整性，包括肝、肾、膀胱等。温暖的温度、机械力和花生四烯酸等脂质介质只是激活TRPV4的少数刺激。研究发现，胃、肺、结肠癌细胞中TRPV4水平较高，而食道、前列腺癌细胞中TRPV4水平较低。TRPV4的异常表达参与了不同类型癌症的发生、生长和转移。抑制TRPV4可通过调节ERK通路抑制细胞增殖，减弱HCC上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。TRPV4的激活影响钙离子内流并诱导一系列参与肿瘤发生的Ca2+依赖性调节。腺苷5′-单磷酸腺苷(AMP)活化蛋白激酶(AMPK)被Ca2+依赖性蛋白激酶激酶β (CaMKKβ)磷酸化和激活，对癌细胞的发育和能量代谢至关重要。TRPV4可能是一个重要的AMPK调节因子。

在此，我们证明了HCC细胞在液相中保持sc极性，并研究了TRPV4在转移过程中如何调节sc极性。我们的假设是TRPV4通过改变钙通量和Ca2+依赖性信号通路来调节sc极性。此外，研究发现新型TRPV4抑制剂GL-V9通过重写sc极有效抑制HCC转移。GL-V9是源自黄芩的生物活性类黄酮黄芩苷的合成衍生物，通过诱导细胞凋亡、周期阻滞和自噬，在几种肿瘤中表现出优于黄芩苷的抗肿瘤作用。然而，目前尚不清楚GL-V9是如何防止转移的。

研究方法

02

细胞培养

在六孔板上涂有聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，进行细胞的非锚定生长。聚hema粉末在95%乙醇中溶解至12 mg/mL。

试剂

GL-V9 (C24H27NO5，(5-羟基-8-甲氧基-2-苯基-7-(4-(pyro -lidin-1-yl) butoxy) 4h - chromen4 -one)，分子量409.47，纯度>99%)，在二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中溶解至0.01 M，作为母液保存在- 80°C。TRPV4特异性激动剂GSK1016790A (# HY-19608)和抑制剂HC067047 (# HY-100208)和肌球蛋白II抑制剂blebbistatin (#HY-13441)购自MedChem Express，溶解于DMSO至5 mM，保存于- 80°C。

细胞内钙离子测定

收集处理后的细胞，用Fluo-4 AM孵育30分钟，然后用PBS洗涤三次，并在HBSS缓冲液中重悬。首先用流式细胞术测定细胞的基础钙离子水平。然后用GSK1016790A激活细胞，测定刺激值。用FlowJo-V10对数据进行处理，重复实验3次。

细胞内钙浓度的测定

sc极性观测

将固定细胞用罗丹明标记的phalloidin染色30min。孵育、洗涤后，在盖盖上加入含DAPI的抗猝灭贴片15-20 μL，静置5 分钟。使用共聚焦相机拍摄视场内细胞的照片，使用F-actin或Ezrin点状结构或帽状结构评估sc极性。每次实验至少产生5张照片，每张照片有30多个细胞。试验进行了三次。

研究结果

03

TRPV4在HCC患者中高表达，通过影响细胞骨架相关蛋白促进HCC细胞的迁移和侵袭

在TRPV通道家族中，研究最多的是TRPV2和TRPV4。我们通过TCGA数据库研究了TRPV家族蛋白在HCC中的RNA表达情况，发现TRPV2和TRPV4在临床HCC患者中高表达。Kaplan-Meier生存曲线分析发现，TRPV2和TRPV4与iii期和iii期和iv期HCC患者有显著相关性，但在所有期和i期和ii期HCC患者无显著相关性。为了更准确地评估转移性HCC与TRPV2或TRPV4之间的预后关系，我们排除了没有淋巴结扩散和肝外转移的I期HCC患者的数据。Kaplan-Meier总生存曲线分析显示，在非一期HCC患者中，TRPV4 RNA高表达与总生存差呈显著正相关，而TRPV2无显著正相关。因此，我们假设高表达的TRPV4对转移性HCC的发展至关重要。

TRPV4调节肝癌细胞的迁移和侵袭

然后，利用TRPV4特异性激动剂GSK1016790A和抑制剂HC067047研究TRPV4在HCC细胞迁移和侵袭中的作用。在无明显生长抑制的情况下，在划痕实验中，GSK增加了MHCC-97H和HCC-LM3细胞的伤口愈合能力，而HC067047则降低了这种能力。在transwell迁移实验和transwell侵袭实验中也分别显示了类似的结果。由此可见，TRPV4调节了HCC细胞的迁移和侵袭。机械上，激活或抑制TRPV4对上皮-间质转化标记物E-cadherin、N-cadherin、vimentin以及基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)和MMP-9的蛋白表达影响不大。最近的研究表明，TRPV4激活诱导Ca2+依赖性ATP释放，进而调节食管上皮细胞的机械感觉和伤口愈合。在MHCC-97H和HCC-LM3细胞中，GSK1016790A或HC067047对TRPV4的调控对ATP的产生和糖酵解没有影响，但它显著改变了细胞骨架相关蛋白MLC和ROCK1的水平。AMPK可以磷酸化并激活MLC。GSK1016790A增加了AMPK和MLC的磷酸化以及ROCK1蛋白的表达，而HC067047则有相反的影响。因此，TRPV4通过干扰AMPK/MLC和ROCK1影响细胞骨架，促进HCC细胞的迁移和侵袭。

GL-V9通过抑制TRPV4抑制HCC细胞的迁移、侵袭和sc极性

既往研究表明，GL-V9通过抑制PI3K/AKT和MMP-2/9信号通路抑制人结直肠癌细胞的侵袭和迁移，抑制乳腺癌细胞的非锚定生长。在没有增殖抑制浓度的情况下，用GL-V9处理MHCC-97H和HCC-LM3细胞，可显著降低迁移和侵袭，以及AMPK、MLC和ROCK1蛋白的磷酸化。GSK1016790A促进了HCC细胞的迁移，而GL-V9逆转了这一作用。

GL-V9通过抑制TRPV4和调节细胞骨架相关蛋白来阻止HCC细胞的迁移和侵袭

另一方面，低于4 μM的GL-V9处理对悬浮培养的MHCC-97H细胞的生长没有明显的影响，与HC06704相同，GL-V9显著降低sc极化细胞的比例，并减弱GSK1016790A的促进作用，与HC06704相同。GL-V9还灭活了悬浮生长的HCC细胞的AMPK/MLC/ERM信号轴，并消除了GSK1016790A对AMPK/MLC/ERM轴的激活作用。进一步的研究表明，GL-V9抑制悬浮培养的MHCC-97H细胞对HUVEC的粘附和跨内皮迁移。众所周知，sc极性的运动模式类似于变形虫的运动模式。我们利用活细胞工作站观察悬浮培养的MHCC-97H细胞的快速阿米巴运动轨迹。暴露于GL-V9后，细胞运动的距离和速度都明显降低。因此，TRPV4抑制剂GL-V9使悬浮HCC细胞的AMPK/MLC/ERM轴失活，抑制sc极性、对HUVEC的粘附和跨内皮迁移。

以上研究表明，TRPV4是一个很有希望的预防癌症转移的治疗靶点。TRPV4的激活通过调控ROCK1重塑细胞骨架，并通过AMPK/MLC/ERM轴促进sc极性，从而影响转移性癌细胞的迁移、侵袭和血管粘附。重要的是，临床前研究表明，TRPV4抑制剂GL-V9具有强大的抗转移作用和低毒性。临床研究将需要评估抑制TRPV4和sc极性以靶向癌症转移的治疗潜力。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41419-023-05903-z

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊