中国科学院与哈佛医学院联合发布：可用于整合代谢、细胞死亡和炎症的新发现

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作者：Floyd

导读：AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase） 即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。

AMPK表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。由于分子机制十分复杂，药物分子激活AMP是一个巨大的挑战，但其激活能改善由II型糖尿病引起的代谢失衡。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn1725#supplementary-materials

研究背景

01

一个关键的磷酸化事件将细胞的代谢状态与细胞死亡和炎症的控制联系起来。腺苷单磷酸依赖蛋白激酶(AMPK)是细胞营养状态和能量状态的传感器。

研究团队发现，在营养缺失的细胞中，活化的AMPK磷酸化并抑制受体相互作用蛋白激酶1 (receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)，从而抑制细胞死亡和炎症。在更长时间的营养胁迫下，这种抑制作用消失，导致细胞死亡。这些结果也证实了RIPK1在缺血引起的细胞死亡中的作用，从而暗示AMPK-RIPK1相互作用是一个潜在的治疗靶点。

研究方法

02

细胞系和细胞培养

所有细胞在37℃、5% CO₂条件下培养。人细胞系的培养方法为:HEK293T (ATCC)在含10%牛血清(GIBCO)和1%青霉素/链霉素的DMEM (GIBCO)中培养;Jurkat (ATCC)在rpm -1640 (Life Technologies)中添加10% FBS和1%青霉素/链霉素。所有小鼠细胞系和原代细胞在含10%牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。葡萄糖饥饿时，用PBS洗涤细胞3次，然后在不含葡萄糖的DMEM中培养，DMEM中添加10%的透析FBS (Invitrogen)和100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素(Gibco)。

MEF的产生和永生化

用胰蛋白酶/EDTA从E11-13胚胎中分离MEF，并通过70微米过滤器筛选。在高糖DMEM中添加15% FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠、青霉素、链霉素和两性霉素b。在第4-6代，用Lipofectamine 2000转染SV40大T抗原表达质粒(Addgene 22298)使MEF永生化。

细胞毒性及活力分析

通过测定碘化丙啶(PI)的质膜完整性来分析细胞死亡。将PI直接加入培养液中，孵育10 分钟，在倒置荧光显微镜下计数细胞总数和PI阳性细胞。对每个样本(超过1500个细胞)的4个字段的细胞进行计数。数据以PI阳性细胞占总细胞数的百分比表示。

细胞毒性试验

TUNEL分析

使用原位细胞死亡检测试剂盒，POD(罗氏)，按照制造商的方案，使用TUNEL法检测DNA断裂的死亡细胞。

TUNEL法

ALT、AST测定

为了在酶水平上确定肝损伤，根据制造商的说明，使用enzymatic™Alanine Transaminase Assay Kit (BioAssay Systems，目录号:EALT-100)和kinetic method (TECO Diagnostics, california, usa，目录号:A525-240)测量血清ALT活性。根据制造商的说明，使用酶切™天冬氨酸转氨酶测定试剂盒(BioAssay Systems，目录号:east -100)或动力学法(TECO Diagnostics, california, usa，目录号:A560-240)测定血清AST活性。

统计分析

细胞死亡测量数据以一次代表性实验的平均值±标准差表示。每个实验至少重复3次。数据以所示n值的平均值±s.e.m.表示。所有免疫印迹独立重复至少三次，结果相似。免疫印迹定量采用ImageJ软件进行密度分析，参数相同。统计参数包括确切样本量(n)、事后检验和统计显著性在每个图和图图例中都有报告。在初步试验的基础上，估计数量是足够的。采用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。在进行统计分析前，采用Shapiro-Wilk检验检验样本的正态性。

对于正态分布，对两组间的比较采用非配对双尾Student’s t检验，或对多组间的比较采用单对照单因素单因素方差分析，而对于非正态分布，对两组采用Mann-Whitney检验，或对多组比较采用Kruskal-Wallis检验后进行Dunnett检验进行非参数统计分析。对不同时间点收集的一系列数据采用双因素方差分析进行统计比较。体内生存数据的意义通过log-rank (Mantel-Cox)检验确定。以P < 0.05为差异有统计学意义。

研究结果

03

腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性被刺激以促进能量应激下的代谢适应。然而，持续的代谢应激可能导致细胞死亡。AMPK决定细胞死亡的机制尚不完全清楚。我们的研究显示，代谢应激促进了TRAIL受体介导的受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)的激活，而AMPK通过在Ser415位点磷酸化抑制RIPK1，从而抑制能量应激诱导的细胞死亡。通过AMPK缺乏或RIPK1 S415A突变抑制pS415-RIPK1可促进RIPK1的激活。此外，RIPK1基因失活对髓系AMPK α1缺陷的缺血性损伤有保护作用。我们的研究表明，AMPK磷酸化RIPK1代表了一个重要的代谢检查点，它决定了细胞对代谢应激的命运反应，并强调了AMPK-RIPK1轴在整合代谢、细胞死亡和炎症中的作用。

参考资料：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn1725#supplementary-materials

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。