【Nature子刊】新策略！克服耐药性、有效控制头颈癌

我国头颈部癌（含鼻咽癌）每年新发病例13.5万例，发病率排名第7，死亡病例数36,600名患者，死亡率排在第七位。

活性氧(ROS)参与癌症治疗，并作为微环境肿瘤细胞适应的驱动因素。医用气体等离子体是一种多ROS生成技术，在肿瘤细胞适应氧化应激和生长发生致命退化之前，已被证明对头颈癌(HNC)患者的缓和性肿瘤控制有效。

https://www.nature.com/articles/s41416-023-02343-6

研究背景

 01 

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第六大常见恶性肿瘤，每年新发病例超过80万例。除了遗传基因使个体易患这种特定肿瘤外，肿瘤的发生主要是由持续暴露于大量吸烟和饮酒等致癌物所致。此外，高危型人乳头瘤病毒(HPV)的预感染被认为使患者有发生HNSCC的风险。尽管近几十年来在诊断和实施新的治疗方法方面有所改进，但HNSCC患者的预后仍然很差，5年总生存率低于50%。传统治疗策略的严重副作用和癌细胞的多药耐药是临床医生就诊的主要障碍，限制了治疗选择，甚至在积极的联合治疗策略中也会导致肿瘤复发。为了改善患者的预后和生活质量，迫切需要新的治疗策略。

近年来，医用气体等离子体技术已成为皮肤肿瘤学研究的热点。与其他已应用于临床肿瘤学的活性氧(ROS)和氮种(RNS)生成疗法(如光动力疗法)类似，这种创新的治疗方式通过靶向肿瘤氧化还原状态来激发其抗肿瘤活性。体外和体内临床前研究是有希望的，并且已经报道了治疗难治性头颈癌患者的有益结果。气体等离子体能够同时产生大量高活性的ROS/RNS，对细胞内生物分子造成不可逆的损伤，从而诱导细胞死亡信号通路，这是独一无二的。尽管有直接的肿瘤毒性作用，血浆来源的活性氧在HNSCC中有额外的优势。由于其抗菌功效，它们可以减少晚期肿瘤的微生物生长，在晚期肿瘤中，组织污染伴随着不良气味，对社会交往和患者的生活质量产生负面影响。然而，在某些情况下，由于最初反应的患者获得性耐药而导致的肿瘤复发可能是一个主要挑战。一个临床病例强调了阐明肿瘤对医用气体等离子治疗适应机制的必要性，该病例在一名54岁男性患者中观察到肿瘤部分缓解，该患者在被诊断为口腔底溃疡性、超感染鳞状细胞癌后接受了预期的姑息性气体等离子治疗。不幸的是，当患者仍在接受气体等离子治疗时，8个月后病情进展，不久就去世了。

为此，我们在体外建立了两种鳞状细胞癌细胞系反复气体等离子体暴露的模型系统。A431和SCC-25在8个治疗周期中每周暴露于气体等离子体。比较了野生型(WT)和反复暴露(RE)癌细胞在毒性、细胞内ROS水平、细胞衰老和20种不同细胞因子和生长因子释放方面的细胞反应。全转录组基因表达分析用于鉴定与适应气浆诱导毒性相关的差异表达基因。在HNSCC体内异种移植模型中进一步研究了WT和RE A431细胞的治疗反应。

总的来说，本研究首次全面研究了恶性细胞对医用气体等离子体诱导的反复氧化应激条件的适应过程，并可能有助于确定在这种情况下克服耐药性的潜在靶点。

研究结果

 02 

人鳞状细胞癌细胞对体外反复气体等离子体暴露的适应

医用气体等离子体技术已被成功证明可以减轻晚期头颈部癌患者的肿瘤负担，但如前所述，获得性治疗耐药性可能是一个主要挑战。为了研究潜在的体外分子机制，建立了一个标准化的气体等离子体暴露模型系统。因此，每周将人鳞状细胞癌细胞SCC-25和A431暴露于医用气体血浆中，共8个治疗周期。在对野生型(WT)和反复暴露(RE)细胞进行气浆处理后，收集细胞和培养上清液进行下游分析。与SCC-25相比，A431细胞计算出的抑制浓度25 (IC25)显示出更高的灵敏度，并预先确定为后续实验的最终暴露时间。在这些治疗条件下，人类非恶性HaCaT角质形成细胞受到的影响较小，因为它们的计算IC25比恶性细胞高，这表明血浆有部分选择性。在这种情况下，等离子体处理产生40µM过氧化氢(H2O2），在24小时内保持稳定。此外，短寿命物种，包括羟基自由基(.OH)，过氧亚硝酸盐(ONOO−)，单线态氧(1O2)和一氧化氮(NO)。有趣的是，在细胞存在的情况下，ROS/RNS的相对和绝对水平被发现降低。单次处理24小时后，在A431和SCC-25细胞中观察到表明终末细胞死亡的形态学改变。在多次处理周期后，未发现细胞圆圆，而在对照和气体等离子体处理的细胞中，反复暴露后细胞变大，结构变少。血浆处理24小时后没有增殖损伤，这表明在多个处理周期后，SCC-25和A431细胞对气体血浆的敏感性显著降低。使用两种不同的方法，流式细胞术分析细胞计数表明增殖和细胞活力减少较少，进一步证实了抗性的建立，验证了RE细胞的气浆不敏感。细胞周期改变是慢循环持久性细胞的一个标志，最近与对活性氧的抗性有关。为此，我们研究了气体等离子体处理后24 小时细胞周期G1和G2期野生型和反复暴露细胞的分布情况。流式细胞术分析G2/G1比率显示，在多个气浆挑战的A431细胞中，G2骤停显著增加。气体血浆介导的毒性被认为是ROS/RNS依赖的。短命物种可能相互作用形成能够不可逆地修饰和破坏细胞蛋白的次级因子，导致细胞终末死亡信号。评估细胞内生物分子的酪氨酸硝化作用是监测细胞氧化应激的基准测试。有趣的是，流式细胞术分析反复暴露的癌细胞中的3-硝基酪氨酸残基显示，与野生型细胞相比，A431和SCC-25细胞的基线增加。类似地，反复暴露的A431细胞显示出氧化GSH (GSSG)的基础水平升高，但在血浆处理后能够保持稳定的GSH/GSSG比率。对氧化应激的短暂适应通常涉及参与抗氧化防御的酶的重新合成。Western blot检测过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD) 1的表达显示，重复血浆处理后，细胞中过氧化氢酶(Supplementary Fig. S4c)和SOD1的基线表达水平升高。有趣的是，在WT和RE细胞中，SOD1的表达在血浆处理后6小时降低，但在24小时后恢复。

建立的长期细胞培养的示意图概述

我们已经证明，反复暴露于气浆源性ROS/RNS可以触发具有干细胞样特征的鳞状细胞癌细胞的弹性表型。改变EGFR的表达或VEGF的释放可以作为治疗气体等离子肿瘤的靶点，在多模式方法中使用已被批准的抑制剂。同样，靶向治疗IL1R2也很有希望，但潜在的信号通路仍有待阐明。

重复的气体等离子暴露会引起更不敏感的癌细胞表型，并与增加的癌症干细胞特性(如增强的g2期阻滞、更高的细胞内ROS基础水平和细胞大小增大)相关。此外，体外促血管生成分子的分泌增强和体内抗免疫原性表面标记物的表达增加，揭示了持久细胞更致瘤性和更少炎症的表型。IL1R2与已建立的无应答性相关，使该受体成为克服气浆诱导耐药和开发新治疗方法的潜在靶点。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41416-023-02343-6

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。