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2023年10月3日，浙江大学/南开大学/中国医学科学院/北京协和医学院曹雪涛团队在Cell Reports 在线发表题为“Enzymolysis-based RNA pull-down identifies YTHDC2 as an inhibitor of antiviral innate response”的研究论文，该研究开发了一种基于酶解的RNA pull-down(eRP)方法，利用酿脓链球菌(IdeS)的免疫球蛋白G降解酶来提取m6 A修饰的RNA相关蛋白。该研究利用eRP捕获甲基化单链RNA (ssRNA)探针相关蛋白，并鉴定YT521-B同源结构域2 (YTHDC2)为m6 A修饰的干扰素β (IFN-β) mRNA结合蛋白。YTHDC2在病毒感染后期在巨噬细胞中被诱导，募集IFN刺激的外切酶ISG20 (IFN刺激的外切酶基因20)来降解IFN-β mRNA，从而抑制抗病毒先天免疫反应。体外和体内缺乏YTHDC2会增加病毒感染后期IFN-β的产生。

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113192

研究背景

 01 

感染诱导的先天免疫反应是清除病原体的关键。同时，许多策略已经在宿主体内发展，以确保及时终止先天免疫反应，以防止不必要的炎症和组织损伤。例如，生产足够的Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可确保清除病毒;然而，在病毒感染后期，IFN-Ⅰ的表达也受到不同类型的负调控因子的抑制。适当抑制IFN-Ⅰ产生的失败将增加慢性感染和炎症性自身免疫性疾病发展的风险。因此，需要进一步研究紧密调节先天反应和炎症的新途径。

基因表达的转录后调控在控制先天免疫反应的大小和持续时间方面发挥着重要作用。其中，n6 -甲基腺嘌呤(m6A)修饰在先天免疫转录物的转录后调控中起着关键作用，特别是在易位、翻译和稳定性方面。特别是，有报道称m6A修饰降低了IFN-β mRNA的稳定性，促进了病毒的传播。然而，先天免疫应答中IFN-Ⅰ表达的转录后调控的详细机制在很大程度上仍然未知。

eRP有效鉴定YTHDC2为m6A-RBP

 02 

研究人员应用eRP方法鉴定了m6a修饰的rbp对病毒感染的反应。研究人员发现，与使用传统RP (tRP)相比，使用eRP大大降低了洗脱液中的非特异性蛋白质噪声。在传统RP (tRP)中，用沸腾或过量的生物素洗脱靶蛋白，eRP有效地拉低了与m6a修饰的ssRNA探针结合的蛋白，特别是在180 kDa左右。然后，研究人员对180 kDa左右的差异带进行质谱分析，并鉴定出几种m6a修饰的rbp，包括那些参与pre-mRNA剪接、加工和翻译的rbp，如Gemin5、Cpsf1和Eif3a。这些结果与先前报道的m6A修饰的功能一致。出乎意料的是，研究人员还发现了参与DNA修复、内吞作用、细胞凋亡和nod2诱导的免疫反应的蛋白，如Fanca、Eea1、Uaca和Mapkbp1，表明m6A修饰在巨噬细胞介导的抗病毒先天反应中具有其他调节功能。研究人员使用小干扰rna (sirna)筛选这些蛋白在调节IFN-β mRNA表达中的功能，结果显示EEA1和YTHDC2两个候选蛋白与对照组相比，在巨噬细胞中增加了IFN-β mRNA的表达。YTHDC2是DExD/H盒RNA解旋酶家族的一员，在细胞RNA代谢中发挥多功能作用。

研究人员证实，在水疱性口炎病毒(VSV)感染的RAW264.7细胞中，YTHDC2与m6a修饰的RNA相互作用。研究人员进一步发现，VSV、poly(I:C)或5 '双链RNA (dsRNA)均可显著诱导YTHDC2的表达，尤其是在感染VSV或poly(I:C)或5 ' dsRNA后12小时。然后，研究人员分析了YTHDC2的启动子，并确定了IFN信号转录因子STAT1的预测结合位点。研究人员证实，VSV感染后，YTHDC2启动子上STAT1的结合水平显著升高，表明YTHDC2是通过IFN信号诱导的。与此一致的是，研究人员发现IFN-β处理的小鼠巨噬细胞和RAW264.7细胞中YTHDC2 mRNA的表达显著上调。此外，在IFN-β处理的小鼠巨噬细胞和RAW264.7细胞中，YTHDC2蛋白水平显著升高，而在IFN- i受体阻断的小鼠巨噬细胞和RAW264.7细胞中，YTHDC2蛋白水平无显著升高。综上所述，这些结果表明YTHDC2是一个IFN刺激基因(ISG)，可以与m6a修饰的RNA结合，参与病毒感染后IFN-β表达的调控。

eRP鉴定YTHDC2为m6A rna结合蛋白

YTHDC2在病毒感染晚期抑制体外和体内IFN-β的表达

 03 

由于YTHDC2已被证实可促进IFN-β mRNA降解，研究人员随后研究了YTHDC2是否对抗病毒先天反应有抑制作用。研究人员发现，在缺乏ythdc2的腹膜巨噬细胞和沉默ythdc2的腹膜巨噬细胞中，VSV-G RNA和VSV-G蛋白均显著降低。因此，感染VSV后，缺乏ythdc2的腹腔巨噬细胞和沉默ythdc2的腹腔巨噬细胞中ISG如Ifit1和Mx1的表达也增加。为了进一步证明YTHDC2的功能，研究人员使用CRISPR-Cas9系统生成了YTHDC2缺陷的RAW264.7细胞。研究人员发现，缺乏YTHDC2可以保护RAW264.7细胞免受高剂量VSV感染。然而，在感染VSV后，在缺乏YTHDC2的腹膜巨噬细胞和沉默YTHDC2的腹膜巨噬细胞中，虽然Il6的表达也增加，但另一种促炎细胞因子Tnf的表达没有明显变化，这表明YTHDC2可能具有选择性调节病毒诱导的炎症的功能。

YTHDC2在体外和体内抑制病毒感染晚期IFN-β的产生和先天反应

研究结论

 04 

综上所述，研究人员开发了一种基于酶解的RNA(eRP)方法，该方法使用IDE降解IgG抗体以洗脱m6a修饰的RNA相关RBP。利用eRP，研究人员在巨噬细胞中发现YTHDC2是m6a修饰的IFN-β mRNA的结合蛋白，并发现YTHDC2招募IFN-刺激的外切酶ISG20 (IFN-刺激的外切酶基因20)来降解IFN-β mRNA，从而在病毒感染后期终止先天免疫反应。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113192

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。