【Genome Med】浙大学者研究发现携带抑癌基因突变的小eccDNA推动小鼠肝癌模型肿瘤内异质性演化

近日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院/浙江大学转化医学研究院谢安勇课题组和浙江大学医学院附属邵逸夫医院林辉课题组联合浙江大学转化医学研究院刘鹏渊课题组在《Genome Medicine》发表论文“Small extrachromosomal circular DNA harboring targeted tumor suppressor gene mutations supports intratumor heterogeneity in mouse liver cancer induced by multiplexed CRISPR/Cas9”，研究揭示携带抑癌基因（Tumor suppressor gene,TSG）突变的小eccDNA是CRISPR/Cas9小鼠肝癌模型ITH演化的重要推动力量。

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01230-2

研究背景

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原发性肝癌的分子分析显示ITH显著，这是由于肝癌难以有效治疗。原发性肝癌在全球癌症发病率方面排名第七，在癌症相关死亡率方面排名第三。肝细胞癌是最常见的肝癌形式，占~90%的病例。尽管对肝癌的认识有所提高，但ITH的发展仍然是这种疾病生物学的基本问题之一。小鼠模型为研究肝癌ITH提供了重要工具。

CRISPR/Cas9是一种强大的基因编辑技术，已被用于通过灭活肿瘤抑制基因（TSG）或激活体细胞中的癌基因来快速生成人类癌症小鼠模型。CRISPR/Cas9介导的小鼠肝诱导的肝内胆管癌（ICC）（第二种原发性肝癌）中p53和Pten的靶向失活。多路复用CRISPR/Cas9也被探索用于TSG的高通量分析，以引发和发展肝癌。在这些应用中，CRISPR/Cas9诱导体细胞中的DNA双链断裂（DSB），并通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复这些DSB，产生诱导肿瘤转化的编辑产物。

研究进展

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为了使用多重CRISPR / Cas9诱导小鼠肝肿瘤，我们选择了34个TSG和Setd5位点的5′上游位点作为CRISPR / Cas9介导的基因失活的阴性对照（图1A）。这34个TSG参与至少11个癌症相关的信号通路（图1A）。我们为每个靶基因（p53除外）设计和构建了至少3个sgRNA，并使用之前建立的BGN报告基因分析了这些sgRNA的移码编辑效率。将包含每个sgRNA的PAM的23 bp靶序列插入BGN报告基因的I-SceI-EcoRI位点。

为了测试每个sgRNA，将Cas9和sgRNA的表达质粒以及含有Cas9-sgRNA靶标的BGN报告质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3细胞中，并通过流式细胞术测量GFP细胞的“3n + 1”-bp移码频率。在对每个sgRNA进行测试后，我们为每个靶基因选择了最有效的sgRNA，以建立35个sgRNA的质粒库。然后，我们使用流体动力学尾静脉注射（HTVI）将这种sgRNA质粒文库与化脓性链球菌Cas9（SpCas9）表达质粒混合到小鼠肝细胞中以诱导肝肿瘤。进样的总体积为2 mL，每只小鼠的SpCas9质粒量固定为200 μg。进样的sgRNA文库中每种sgRNA的量范围为0.005μg至5μg（图1B）。在30-60天内在小鼠中形成并可见肝肿瘤（图1B-C）。sgRNA的稀释延缓了Cas9 / sgRNA诱导的小鼠肝癌的发展并减少了癌症诱导（图1B）。将每个sgRNA降低到0.2μg后，肿瘤发展很少发生（图1B）。肿瘤结节的组织学分析表明，肿瘤结节中的肝小叶结构被破坏（图1D）。HCC生物标志物AFP和GP73以及ICC生物标志物CK19的免疫染色显示，在CRISPR/Cas9诱导的小鼠肝肿瘤中存在HCC，ICC和混合HCC-ICC类型（图1D）。在单个肿瘤结节的一个切片中，三个选定的区域表现出不同的组织学特征（图1E），表明CRISPR / Cas9诱导的小鼠肝癌具有很强的ITH。

通过CRISPR / Cas9介导的小鼠体细胞诱变诱导原发性小鼠肝癌。

研究结论

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通过分析CRISPR/Cas9诱导的原发性小鼠肝肿瘤和源自肿瘤结节的单细胞克隆中TSG的靶位点突变，我们发现单细胞克隆中许多TSG靶位点存在两种以上频率不同的等位基因变异，亚克隆中某些TSG靶位点的靶位点突变在类型和频率上显著振荡，在亚克隆的增殖期间，以及在亚克隆的小鼠皮下移植物中。这项研究还表明，基因组的不稳定性和小eccDNA的产生可能有助于细胞分裂过程中靶位点突变的振荡。总之，这项研究首次确定了携带TSG靶位点突变的小eccDNA作为多重CRISPR / Cas9诱导的小鼠肝癌IGH发展的潜在来源。因此，与人类癌症，特别是人类肝癌的相关性可能需要进一步研究。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01230-2

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。