第二篇！西湖大学施一公团队合作再取进展

2024年1月9日，西湖大学施一公团队在 Nature 子刊《Nature Structural & Molecular Biology》 发表了题为“Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome”的最新研究论文。研究报道了人源17S U2 snRNP复合物和剪接体pre-A复合物的高分辨率结构，并结合生化和功能实验，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机制。

https://www-nature-com-443.vpnm.ccmu.edu.cn/articles/s41594-023-01188-0

研究背景

 01 

Pre-mRNA的剪接由剪接体执行，这是一种动态的超分子机器。剪接体通过识别内含子的保守元件:5 ' -剪接位点(5 'SS)、BS、聚嘧啶束(PPT)和3 ' -剪接位点(3 'SS)，组装在pre-mRNA上。首先，U1 snRNP、SF1、U2AF2和U2AF1分别识别5'SS、BS、PPT和3'SS，形成E complex。然后，U2 snRNP取代SF1，使U2 snRNA与BS之间形成双工，从而形成A complex。在高等真核生物中，大多数基因通过选择不同的剪接位点进行选择性剪接。因此，选择BS的A complex的形成是剪接调节的焦点。可惜的是，人们对E-to-A转换背后的步骤知之甚少。

RNA解旋酶PRP5(也称为DDX46)在A complex的组装过程中起关键作用。在人类17S U2 snRNP中，U2 snRNA无法与BS配对，因为U2 snRNA的相关序列形成双链BSL。ATP被PRP5水解导致BSL解绕，从而促进U2-BS双相的形成。在酵母中，Prp5可能校对U2-BS双工，因为Prp5突变允许使用隐性BS和3'SS。然而，PRP5调控剪接保真度的机制尚不清楚。

研究结果

 02 

我们首先通过PRP5上引入的Flag标签纯化出内源的17S U2 snRNP并解析了整体分辨率达到2.5 Å的电镜结构。随后通过使用exon-definition的pre-mRNA底物和小分子抑制剂spliceostatin A（SSA），成功组装并捕获了一个介于E和A complex中间的反应状态，命名为pre-A复合物。Pre-A复合物主要包含两个区域：U2 snRNP区域和U1 snRNP区域。其中U1 snRNP非常柔性，未能解析到较高的分辨率，而U2 snRNP区域整体分辨率达到3Å，可以搭建原子模型。

17S U2 snRNP和pre-A复合物的电镜结构

人 17S U2 snRNP 和 pre-A 复合物的结构分析提出了 BS 识别和校对的工作模型。尽管 PRP5 的 RNA 解旋酶结构域在这两种复合物中的位置完全不同，但酸性环和两个周围的螺旋以相同的方式锚定在 SF3B1 上（图 7a，b）。值得注意的是，PRP5结合的SF3B1以开放构象存在。相比之下，SF3B1 在组装的剪接体中采用封闭构象，其中 PPT 而不是 PRP5 的酸性环被容纳在 RNA 路径中（图 7c）。

17S U2 snRNP到A complex过程中的结构变化以及PRP5校正U2/BS duplex的模型图

在组装 A 复合物的过程中，17S U2 snRNP 通过与 SF1 的相互作用被带入 BS 附近。然而，由于 TAT-SF1 的保护，前体 mRNA 无法进入 BSL（图 7a）。在 ATP 结合和水解的推动下，PRP5 可能拉动 U2 snRNA 的 5′-末端以解开双链 BSL，从而破坏其与 TAT-SF1 的相互作用（图 7d）。打开的 BSL 序列又与 BS 配对，形成初始 U2–BS 双工。在这种中间状态下，SF1 尚未与 BS 完全解离。相反，它将初始 U2–BS 双链体与 SF3A3、SF3A2-ZnF 和 PRP5 的解旋酶结构域结合在一起。DNAJC8 在铰链口袋的另一侧与 SF3B1 特异性相互作用（图 7d）。

尽管PRP5对BS的机制尚不清楚，但我们对17S U2 snRNP和pre-A复合物的结构提出了一种PRP5通过竞争机制校对初始U2-BS双链体的模型。在pre-A复合物中，PRP5的解旋酶结构域与初始U2-BS双链体密切相互作用，而PRP5的酸性环占据RNA路径，使其无法被pre-mRNA接近。涉及次优 BS 的初始 U2-BS 双链体更有可能屈服于 PRP5 的活性，导致次优 BS 与 U2 snRNA 解离。相反，涉及最佳 BS 的初始 U2-BS 双链体不太可能被 PRP5 破坏，从而为下游 PPT 和 3′SS 序列提供了更好的机会，从 RNA 路径中胜过 PRP5 的酸性环，最终导致 PRP5 解离。伴随着PRP5的释放，BPA被停靠在铰链袋中，SF3B1变成封闭的构象（图7d）。

研究结论

 03 

本研究，我们报告了导致前剪接体组装的两个连续复合物的原子结构：人 17S U2 snRNP 和交叉外显子 pre-A 复合物。PRP5 主要通过 PRP5 的酸性环占据 SF3B1 的 RNA 路径锚定在 17S U2 snRNP 上;PRP5 的解旋酶结构域与 U2 snRNA 相关;U2 snRNA 的 BS 相互作用茎环 （BSL） 被 TAT-SF1 屏蔽，无法与 BS 结合。在pre-A复合物中，形成初始的U2-BS双链体;PRP5 的易位解旋酶结构域与 U2 snRNA 保持在一起，酸性环仍占据 RNA 路径。pre-A 构象由剪接因子 SF1、DNAJC8 和 SF3A2 特异性稳定。SF3B1 中的癌症衍生突变破坏了其与 PRP5 的关联，从而影响了 BS 校对。总之，这些发现揭示了PRP5对剪接体前组装和BS选择或校对的关键见解。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www-nature-com-443.vpnm.ccmu.edu.cn/articles/s41594-023-01188-0

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。