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新年新气象！何川团队NBT，Nat Methods及Mol Cell三连发

首页 » 《转》译 2024-01-15 转化医学网赞(2)

导读	虽然DNA N6-甲基脱氧腺苷(6mA)在细菌和原生生物中含量丰富，但其在哺乳动物基因组中的存在和功能尚不清楚。

2024年1月11日，芝加哥大学何川团队在《Molecular Cell》发表了题为“Sequencing of N6-methyl-deoxyadenosine at single-base resolution across the mammalian genome”的研究论文，该研究提出了一种不依赖抗体直接读取6mA测序(DR-6mA-seq)的方法，以碱基分辨率测量6mA。DR-6mA-seq采用一种独特的基于突变的策略来揭示6mA位点作为错误结合的特征，而不需要任何化学或酶对6mA进行调节。DR-6mA-seq提供了一种以单碱基分辨率检测6mA的工具，可以全面了解真核生物中的DNA 6mA。

另外，2024年1月10日，芝加哥大学何川团队在《Nature Methods》发表了题为“Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing”的研究论文，该研究提出了一种基于逆转录的RBP结合位点测序(ARTR-seq)的检测方法，该方法依赖于抗体引导下RBP结合RNA的原位逆转录来识别RBP结合位点。ARTR-seq避免了紫外线交联和免疫沉淀，允许从少至20个细胞或组织切片中高效和特异性地鉴定RBP结合位点。利用快速甲醛固定的优势，ARTR-seq能够在短时间内捕获RBP的动态RNA结合，正如在短至10分钟的时间范围内对应力颗粒组装过程中G3BP1的动态RNA结合的分析所证明的那样。

2024年1月2日，芝加哥大学何川及戴庆共同在《Nature Biotechnology》发表题为“Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA”的研究论文，该研究提出了超快BS-seq (UBS-seq)，它使用高浓度亚硫酸氢盐试剂和高反应温度将亚硫酸氢盐反应加速约13倍，从而减少DNA损伤和降低背景噪声。UBS-seq允许从少量纯化的基因组DNA构建文库，例如来自无细胞DNA或直接来自1至100个小鼠胚胎干细胞，与传统的BS-seq相比，对5mC水平的高估较少，基因组覆盖率更高。此外，UBS-seq从低输入的mRNA定量绘制RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)，并允许在高度结构化的RNA序列中检测m5C化学计量学。UBS-seq结果确定了NSUN2是主要的“书写”蛋白，负责HeLa mRNA中约90%的m5C位点的沉积，并揭示了哺乳动物mRNA 5 ' -区域中富集的m5C位点，这可能在mRNA翻译调节中具有功能作用。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.12.021

研究背景

共价DNA修饰是多种生物系统中重要的表观遗传标记。其中，n6 -甲基脱氧腺苷(N6-methyl-deoxyadenosine, 6mA)是细菌和原生生物基因组中普遍存在的修饰，在限制性修饰系统、DNA修复、复制、转录、类核分离、基因表达调控等方面发挥着关键作用。尽管6mA在原核生物和低级真核生物中都有很好的特征，但在高级真核生物，尤其是哺乳动物的基因组中，6mA被认为是一种罕见的DNA修饰。

研究设计

由于基于抗体的方法有限，而且哺乳动物中6mA含量较低，新开发的方法不应该依赖6mA抗体识别，而是要利用其他生化反应或过程。研究人员注意到，尽管6mA与脱氧胸苷(dT)配对时和未修饰的脱氧腺苷(dA)一样，但是由于6mA甲基存在使得Watson-Crick碱基配对变得不稳定。这个观察结果让研究人员考虑通过放大碱基配对过程中氢键形成的差异来区分6mA和dA。本质上说，研究人员采用的方法中使用了一种特殊的三磷酸脱氧胸苷类似物(dTTP)，在引物延伸反应中精确地与dA位点配对，而不是与6mA位点配对。因此，本方法中，研究人员用dTTP类似物代替dTTP，在遇到被修饰为6mA位点时会产生突变信号，而未修饰位点则没有影响。这种策略既简单直接又不依赖抗体，并且可以促进位点修饰水平的定量测量，在其他DNA和RNA修饰映射方面具有潜在应用价值。

研究结果

DR-6mA-seq结果显示，哺乳动物6mA在基因间区、内含子区、LINE元素、SINE元素和LTR中富集，与以前使用DIP-seq的报告一致。哺乳动物6mA的总体丰度在不同组织中存在很大差异，在胶质母细胞瘤中，单个癌基因的表达可以提高其丰度，一些位点的修饰程度很高。这些结果确实支持6mA的存在，尽管在修饰位点和修饰程度方面有一定限制，并且与特定细胞类型（如胶质母细胞瘤）或特定生物过程中的潜在功能相关性有关。此外，本研究结果提供了证据支持6mA和某些组蛋白修饰(尤其是H3K27me3)之间可能存在串扰的假设。研究人员相信，DR-6mA-seq在未来不仅可以用于揭示6mA在不同基因组中的分布，还可以揭示修饰位点的潜在动态变化，以剖析其功能意义。最后，通过弱化Watson-Crick碱基配对，使用dNTP类似物促进与修饰碱基互补的错误整合。这是一种可以应用于检测其他核酸碱基修饰的策略，其敏感性提高了。