【Nature子刊】深圳大学付利团队揭示结直肠癌新发现：胆固醇引发免疫抑制，影响记忆T细胞活性

2024年7月6日，深圳大学医学院药理学系与国际癌症中心付利团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“ATP6V0A1-dependent cholesterol absorption in colorectal cancer cells triggers immunosuppressive signaling to inactivate memory CD8 T cells+”的研究论文。在这项研究中，团队发现，肿瘤细胞内源性ATP6V0A1是一种新颖的关键因素。通过CRC细胞中RABGEF1依赖性内体成熟途径，促进外源性胆固醇的吸收，导致ER衍生的胆固醇水平升高和24-OHC产生，以及TGF-β1表达上调。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-50077-7#Sec11

研究背景

01

肥胖已成为全球健康问题。与肥胖相关的主要风险之一，是患各种类型癌症的可能性增加，包括结直肠癌 （CRC）。越来越多的证据表明，肥胖可以通过脂质代谢重新编辑，影响免疫系统对肿瘤的反应。肥胖通过促进CRC肿瘤细胞中的脂肪酸（FA）代谢，来抑制抗肿瘤免疫。高脂饮食（HFD）诱导的肥胖，下调脯氨酰-4-羟化酶 3（PHD3）的表达，促进CRC细胞中FA的摄取和氧化，剥夺肿瘤微环境（TME）的FA，从而减弱FA支持的CD8 T细胞的抗肿瘤活性。除FA外，TME中的胆固醇，在调节抗肿瘤免疫方面，也起着至关重要的作用。已知TME中适当水平的胆固醇，对于维持CD8 T细胞的抗肿瘤功能，至关重要。相反，过量的胆固醇，可能导致T细胞耗竭。另一方面，肿瘤细胞产生的胆固醇，驱动其免疫抑制重新编辑。CRC细胞中内源性胆固醇的合成增强，可能通过激活YAP信号传导，来促进肿瘤免疫逃逸，或前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）的产生。尽管取得了上述进展，但CRC细胞利用TME衍生的胆固醇，来驱动促进免疫逃逸的代谢变化的作用和机制，尚未得到深入研究。

液泡型ATP酶（V-ATPase）是一种高度进化、保守的质子泵，对于维持多种细胞类型的囊泡PH值和胆固醇稳态，至关重要。V-ATP酶复合物的单个亚基，具有独特的调节功能。一些V-ATP酶亚基亚型，包括ATP6V0A2、ATP6V0A3、ATP6V1C1和ATP6V1E1，在多种肿瘤中高度表达，例如黑色素瘤和乳腺癌。它们通过调节TME衍生的PH值和细胞mTOR通路，来促进转移和耐药性。肿瘤细胞释放的ATP6V0A2的N末端片段，调节乳腺和宫颈肿瘤TME中，巨噬细胞和中性粒细胞的免疫抑制。

在本研究中，团队探讨了肿瘤细胞内源性V-ATP酶亚基，在CRC中通过脂质代谢，调节抗肿瘤免疫活性的作用。团队发现，V-ATP酶亚基ATP6V0A1，与脂质代谢评分呈正相关，与CRC的免疫活性呈负相关。在脂质代谢高的结直肠癌样品中，观察到ATP6V0A1与免疫活性的相关性，但在脂质代谢低的结直肠癌样品中，没有观察到相关性。重要的是，团队发现，肿瘤细胞内源性ATP6V0A1是一种新型免疫抑制因子，可促进CRC细胞中RABGEF1依赖性胆固醇的吸收，从而启动旁分泌TGF-β1/SMAD3信号传导，以使记忆CD8 T细胞失活。此外，团队还探索了靶向ATP6V0A1的免疫治疗的潜在策略。团队的研究结果，有望为研究CRC细胞，利用TME衍生的胆固醇驱动免疫抑制的作用，提供新的见解，从而为CRC免疫治疗，提供新的方向。

研究进展

02

ATP6V0A1通过CRC中的外源性脂质，

促进免疫抑制性TME

已知高脂肪饮食（HFD），会在CRC中诱导免疫抑制性 TME，但其机制尚不清楚。V-ATP酶亚基对于各种细胞类型的脂质稳态，至关重要。为了研究V-ATP酶亚基在CRC肥胖，抑制抗肿瘤免疫中的潜在作用，团队将471个TCGA-COAD样品，根据其脂质代谢途径的转录组水平，分为高脂质代谢和低脂质代谢的两个簇，并比较了24个人的V-ATP酶亚基，在这两个簇中的表达水平。ATP6V0A1、ATP6V0C、ATP6V0D1、ATP6V0D2、ATP6V0E1、ATP6V0E2、ATP6V1B1、ATP6V1D、ATP6V1E1、ATP6V1F、ATP6AP1等11个V-ATP酶亚基的表达，在高脂质代谢的CRC中显著升高。同时，团队根据免疫评分，将TCGA-COAD样品，分为3组。在与高脂质代谢相关的11个V-ATP酶亚基中，ATP6V0A1与免疫活性，呈最强的负相关。这在COAD样本中很明显，因为ATP6V0A1是唯一一个随着免疫评分，从低水平逐渐增加到高水平，而持续下降的亚基。重要的是，在高脂质代谢的CRC中，发现ATP6V0A1表达与免疫活性降低呈正相关；而在低脂质代谢的CRC中，没有观察到相关性。另一方面，在高ATP6V0A1表达的CRC中，高脂质代谢与较低的免疫活性相关；而在低ATP6V0A1 CRC中，高脂质代谢亚群和低脂质代谢亚群之间的免疫活性相当。肿瘤细胞中脂质代谢的增加，与TME中的脂质水平升高，始终相关。上述数据表明，ATP6V0A1对于结直肠癌患者的外源性脂质，抑制抗肿瘤免疫，可能是必不可少的。值得注意的是，ATP6V0A1的消耗，显著减弱了HFD诱导的改变，表明ATP6V0A1通过利用TME中的外源性脂质，在调节CRC免疫逃逸方面，起着至关重要的作用。

HFD诱导的抗肿瘤免疫，抑制所需的ATP6V0A1。

靶向ATP6V0A1恢复记忆CD8 T细胞介导的

CRC抗肿瘤免疫

实验结果表明，肿瘤内ATP6V0A1通过降低记忆CD8 T细胞的有效性，来诱导CRC中的免疫抑制信号传导和免疫逃逸。因此，团队探索了CRC动物模型中，ATP6V0A1抑制的治疗潜力。首先，团队使用基于对接的蛋白质-抑制剂的相互作用和分析，来筛选一组FDA批准的小分子抑制剂，以寻找潜在的ATP6V0A1抑制剂。团队发现，达卡他韦（Dac）是一种临床使用的药物，用于治疗慢性基因型I型和III型丙型肝炎病毒（HCV）感染，能够与ATP6V0A1蛋白结合。团队使用细胞热位移测定法，确认了其相互作用，这是一种通过检测配体，发现后蛋白质热稳定性的变化，来评估药物与细胞和组织中靶蛋白结合的方法。这些检测表明，Dac可以诱导MC38中ATP6V0A1蛋白的热稳定，但不能诱导对照蛋白（β-肌动蛋白）的热稳定和HCT-8 细胞，证实了Dac与这些细胞中ATP6V0A1的结合。有趣的是，Dac与V0A亚基的其他亚型，没有显著结合，表明Dac与ATP6V0A1结合的特异性。接着，团队研究了Dac在体内破坏ATP6V0A1介导的细胞功能的能力。有趣的是，虽然Dac治疗并没有改变NOD/SCID小鼠中，MC38肿瘤的生长。但是，在C57BL/6 J小鼠中，它显著抑制了MC38肿瘤的生长，降低了肿瘤组织中TGF-β1的表达和活化的TME衍生CD44CD8 T细胞。重要的是，Dac处理还显著抑制了人免疫重组huPBMC-NCG小鼠的HCT-8肿瘤生长，但对免疫缺陷的NCG小鼠，没有抑制HCT-8肿瘤的生长。此外，Dac处理，降低了肿瘤组织中TGF-β1的表达，并增强HCT8肿瘤内CD45ROCD8 T细胞的活化。值得注意的是，Dac处理既没有引起小鼠的体重减轻，也没有导致小鼠体内任何的器官毒性，表明了这种治疗的安全性。

Dac以免疫依赖性方式，有效抑制结直肠肿瘤的生长。

研究结论

03

作为结直肠癌发展的危险因素，肥胖会抑制结直肠癌的抗肿瘤免疫。TME衍生的脂肪酸和胆固醇，可以通过代谢依赖性或独立途径，直接调节免疫细胞的抗肿瘤功能。另一方面，TME衍生脂肪酸在CRC细胞中的利用和代谢，通过调节TME中的脂肪酸水平，在免疫逃逸中，起着至关重要的作用。尽管取得了上述进展，但CRC细胞通过TME衍生的胆固醇，抑制抗肿瘤免疫的机制，仍然未知。在本研究中，团队发现肿瘤细胞内源性ATP6V0A1是一种新颖的关键因素，通过CRC细胞中RABGEF1依赖性内体成熟途径，促进外源性胆固醇的吸收，导致ER衍生的胆固醇水平升高和24-OHC产生，以及TGF-β1表达上调。此外，TGF-β1（一种参与抗肿瘤免疫的关键细胞因子）的上调，抑制了记忆CD8 T细胞的激活，并促进了CRC小鼠模型中的免疫逃逸。团队强调，TGF-β1是肿瘤细胞衍生的胆固醇代谢重新编辑，与免疫细胞抑制功能之间的新潜在联系。这些发现，为研究CRC细胞利用TME衍生的胆固醇，抑制抗肿瘤免疫的机制，开辟了新的途径。同时，这些数据，展示了调节胆固醇代谢和抗肿瘤免疫的V-ATP酶亚基的新轨迹。

在本研究中，团队重点关注ATP6V0A1诱导的TGF-β1，在记忆CD8 T细胞失活中的作用。实验数据表明，TGF-βRII可能作为记忆CD8 T细胞中的受体检查点。然而，TGF-β1也有助于调节Treg分化和激活抑制性髓系细胞。此外，TGF-β1也可能通过自分泌途径，在CRC转移中发挥重要作用。在未来的研究中，团队计划探索ATP6V0A1诱导的TGF-β1，对肿瘤细胞和其他免疫细胞的影响。

RABGEF1依赖性途径，对ATP6V0A1诱导的内体成熟，至关重要。由于与脂质代谢较低的人相比，脂质代谢水平高的CRC中的ATP6V0A1升高，因此，外源性脂质，可能是导致CRC细胞中ATP6V0A1表达增加的一个因素。ATP6V0A1的表达，也可能通过由其他关键基因控制的上游分子信号通路升高，这值得在未来，进一步研究。

团队的研究结果，揭示了ATP6V0A1通过抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤进展的新功能。团队证明了，V-ATP酶驱动的免疫逃逸，受结直肠癌（CRC）细胞中胆固醇代谢途径的控制。V-ATP酶在调节细胞和囊泡PH值中，起着至关重要的作用。具有不同V0A亚型的V-ATP酶复合物，在调节PH值方面，发挥不同的功能。值得注意的是，内体酸化将是内体成熟的结果。在促进内体成熟的同时，RABGEF1通路，可以将VPS41和RILP募集到内体，从而通过RILP和ATP6V1G1的相互作用，加强V0亚复合体和V1亚复合物的连锁。因此，通过RABGEF1依赖性途径ATP6V0A1，调节内体成熟的过程，可能不依赖于V-ATP酶的酸化活性。此外，ATP6V0A1可能通过 RABGEF1/VPS41/RILP途径，调节内体的酸化，而不是 V-ATP酶复合物或其V0亚复合物水平的变化。团队计划在ATP6V0A1诱导的胆固醇吸收的背景下，进一步研究RABGEF1途径、内体成熟和囊泡PH值之间的关联。

在本研究中，团队通过靶向抑制ATP6V0A1，为CRC提供了一种新的免疫治疗策略。在结直肠癌中，抗TGF-β1的治疗效果，可能无法取代靶向ATP6V0A1。因为抗TGF-β1治疗，仅部分削弱了Atp6v0a1过度表达对MC38肿瘤生长的促进作用。此外，靶向ATP6V0A1也可能产生与靶向V-ATP酶复合物诱导，不同的效果。不同V-ATP酶亚基与CRC免疫微环境的关系，各不相同。与其他V0A亚型相比，抑制ATP6V0A1，不会影响V-ATP酶复合物的整体水平；并且在免疫逃逸调节中，表现出独特的作用。因此，ATP6V0A1靶向治疗，对于开发有效的抗CRC免疫治疗策略，可能具有独特的意义。实验数据表明，ATP6V0A抑制剂，可以选择性地靶向CRC组织内的肿瘤细胞。然而，团队需要进一步的研究，以确定Dac在 CRC治疗中的靶向特异性。

ATP6V0A1的上调，及其对RABGEF1/24-OHC/TGF-β1 通路免疫逃逸的影响，与CRC中错配修复（MMR）或微卫星不稳定性（MSI）的类型无关。ATP6V0A1在缺陷错配修复（dMMR）和熟练错配修复（pMMR）的CRC 患者中，都过度表达。重要的是，通过表达干扰或抑制剂治疗ATP6V0A1，被证明可以抑制肿瘤生长，并恢复dMMR和pMMR小鼠CRC中的抗肿瘤免疫。免疫检查点阻断在dMMR CRC中，显示出令人惊喜的治疗效果；但在pMMR CRC中，则不然。由于pMMR结直肠癌的免疫治疗面临挑战，团队的研究可能为在这种情况下，增强免疫治疗，提供有前途的策略。