【Lancet】突破性！中科院田捷团队研发出针对神经胶质瘤手术的精确探针！

2024年7月16日， 中科院自动化研究所田捷团队在期刊《The Lancet Discovery Science》上发表了题为“Near-infrared II fluorescence-guided glioblastoma surgery targeting monocarboxylate transporter 4 combined with photothermal therapy”的研究论文。团队的研究结果，强调了CCM-mAb-ICG探针对胶质瘤治疗中FGS和治疗干预的潜在疗效。

https://www.thelancet.com/journals/ebiom/article/PIIS2352-3964(24)00279-2/fulltext#%20

研究背景

 01 

胶质母细胞瘤（GBM）被世界卫生组织归类为中枢神经系统IV级肿瘤，是最恶性的癌症类型之一。诊断为GBM的患者，平均5年生存率较低，仅为 6-8%。

由于GBM经常浸润到对神经功能至关重要的区域，因此，对肿瘤和正常组织之间的实时术中区分，存在强烈的需求。可见光显微外科手术，是神经外科医生常用的一种技术，他们经常面临准确识别神经胶质瘤边界的挑战。由于识别不准确导致的肿瘤切除不完全，可能导致早期复发。

一些常规成像技术，可以帮助外科医生准确观察肿瘤及其周围结构。然而，计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）等传统成像技术，在手术过程中，存在准确定位神经胶质瘤的局限性。

荧光引导手术（FGS）能够使用荧光探针，对肿瘤进行实时术中可视化。然而，荧光探针通常缺乏靶向肿瘤的高特异性。这些探针的光，落在可见光或近红外（NIR）-I 范围（700–900nm）内，使成像质量和肿瘤描绘，容易受到正常组织的自发荧光的影响。此外，肿瘤切除的有效性，进一步受到短发射波长的穿透限制。最近的研究，将NIR-II（波长为1000-1700nm）FGS应用于生物成像，这已经超过了传统的NIR-I FGS。与NIR-I相比，NIR-II成像具有多项优势。

血脑屏障（BBB）通过保护中枢神经系统，在维持健康大脑内部环境中的体内平衡方面，起着至关重要的作用。血脑屏障可防止微生物和毒素进入大脑。然而，脑肿瘤通常会破坏和损害这种保护屏障，导致肿瘤肿块内部和周围的血管通透性增加。

由于胶质瘤患者的这种完整性受损，胶质瘤手术期间的荧光可能不均匀，从而难以在手术过程中提供视觉辅助。BBB具有异质性和独特性，传统的纳米材料仅依靠增强的渗透性和保留性（EPR）效应，在有效穿透肿瘤区域方面，面临挑战。这是大脑相关应用的主要障碍。

膜功能化探针通过利用细胞膜中存在的跨膜蛋白的特性，解决了这些障碍。这一特性，使非选择性粒子能够穿过BBB。癌细胞膜（CCM）增强了涂有CCM的颗粒，穿过BBB的能力。

研究进展

 02 

探针的体内肿瘤荧光成像

将CCM-mAb-ICG（1mg / kg），mAb-ICG（1mg / kg）和ICG（1mg / kg）注射到用作体内肿瘤模型的小鼠尾静脉中，并使用NIR-II成像系统获取荧光图像。将CCM-mAb-ICG探针注射到U87-Luc肿瘤模型（n = 5），4 小时后，在肿瘤区域检测到荧光信号。荧光信号随时间逐渐增加，肿瘤与背景比（TBR）在10小时达到峰值。72小时后，肿瘤的荧光信号与周围组织的荧光信号相似。当mAb-ICG注射到U87-Luc肿瘤模型（n = 5）中，2-12小时的脑荧光信号低于周围组织的荧光信号，表明与CCM-mAb-ICG相比，mAb-ICG穿透BBB的能力不足。24小时内，在肿瘤中观察到荧光信号；48小时达到峰值，并在72小时后逐渐减弱。当单独将ICG注射到U87-Luc 肿瘤模型（n = 5）中，在小鼠头部观察到微弱信号。然而，在肿瘤部位。未检测到特异性信号。120小时后，未检测到荧光。

在300ms曝光时间下，荧光强度在10小时最强，从12小时逐渐降低到24小时，从24小时略微增加到48小时，然后，再次降低。由于ICG的荧光特性，在1000nm处观察到荧光最高强度，而在1200nm处观察到最低强度。这些趋势与500ms、1000ms和2000ms的曝光时间一致。

探针进样后10小时，观察到最高的SBR（2.8），曝光时间为300ms，滤光片为1000nm。随着暴露时间的增加，肿瘤荧光信号增加，背景信号增加。在300ms曝光时，1000nm和1100nm滤光片的SBR相似，但1000nm处的平均荧光强度，大约是1100nm处的3倍，表明1100nm 处的背景信号，减少更显著。

体内肿瘤荧光成像。（a）三种染料的成像效应：CCM-mAb-ICG（探针）、mAb-ICG和ICG，在体内荷瘤小鼠模型中不同时间。（b）不同波长下，CCM-mAb-ICG中MFI随时间的变化。（c）CCM-mAb-ICG SBR在不同波长下，随时间的变化。CCM-mAb-ICG，癌细胞膜-单克隆抗体-吲哚菁绿；MFI， 平均荧光强度；SBR，信号背景比。

探针性能的体外评估

探针注射后10小时，对小鼠进行麻醉，然后进行白光（WL）、NIR-II、BLI成像。随后，对小鼠实施安乐死，并解剖脑组织以进行额外的BLI成像。结果表明，NIR-II和BLI定位之间存在很强的相关性，探针与肿瘤具有特异性结合。然后，对小鼠脑组织进行切片并进行免疫组化。HE染色中的肿瘤区域与免疫组化染色中的强阳性信号相对应。在高倍显微镜下检查免疫组化染色，可以清楚地区分正常脑组织和肿瘤组织。使用IHC Profiler ImageJ 插件进行图像分析，显示肿瘤和正常组织之间MCT4的平均光密度，存在显著差异。为了增强可视化效果，合并了HE染色和荧光信号。使用更高（20×）的放大倍率，来研究探针与肿瘤细胞的结合位置。荧光信号明显较弱，合并后，荧光信号主要在肿瘤细胞表面观察到，表明探针具有良好的特异性。

探针体外靶向和BBB浸润

共聚焦显微镜结果显示，CCM-mAb-ICG探针和DiI共定位在肿瘤细胞膜上，mAb-ICG也与DiI共定位。然而，ICG不与细胞特异性结合。此外，使用bEnd.3细胞建立的体外BBB模型表明，CCM涂层使探针能够穿透紧密互连的血管内皮细胞。计算出基底外侧和顶端腔室的MFI值之间的比率，以推断探针穿透BBB的能力，CCM-mAb-ICG、mAb-ICG和ICG的比率，分别约为0.47、0.3和0.07。

体外和体内光热效应

考虑到探针在细胞和体内水平的肿瘤靶向能力，以及ICG的光热效应，探针可能在细胞和体内水平上，表现出肿瘤靶向能力和光热效应。团队比较了PBS、探针和ICG在体外和体内的光热消融效果。结果表明，经过300s的体外照射，探针的温度可达到53.9 °C。在体内激光照射300s后，探针可将肿瘤组织的温度升高至50.3 °C。从肿瘤细胞植入后第10天，开始记录肿瘤大小，当时肿瘤直径约为1毫米。直到第18天才观察肿瘤大小，然后解剖肿瘤。基于这些结果，探针光热处理可以抑制肿瘤生长，并且由于ICG的EPR效应，ICG组显示出比PBS组更好的结果。此外，在注射探针后切片重要器官，组织病理学结果证实，探针没有组织毒性。

体外和体内光热效应。（a） 光热疗法过程的视觉表示。（b）探针光热治疗性能的体内验证。（c）探针光热治疗性能的体外验证。（d）探针在不同浓度下的光热处理性能。（e） 探针注射后重要器官的组织病理学结果。比例尺：100μm。（f） 离体肿瘤大小。（g） 使用不同探针进行光热治疗后的肿瘤生长曲线。（h）用不同探针进行光热治疗后小鼠的生存曲线。

研究结论

 03 

FGS在临床实践中，变得越来越普遍。然而，大多数研究，都集中在成像分辨率和深度有限的NIR-I窗口 （700-900 nm）上。NIR-II成像的优点，包括散射减少、吸收最小和自发荧光可忽略不计。

共聚焦显微镜表明，团队设计的探针，在细胞水平上表现出出色的肿瘤细胞靶向性。在小鼠中使用NIR-II技术进行体内成像表明，该探针允许对肿瘤进行特异性成像，SBR为2.8。使用探针的FGS导航，术后病理结果显示，脑组织中没有残留肿瘤细胞，SBR为6.3，没有头皮或颅骨梗阻。脑组织的HE染色显示，肿瘤中存在荧光信号，但在正常脑组织中不存在。在高倍率下，荧光信号分布在肿瘤细胞膜上。transwell检测结果表明，CCM-mAb-ICG穿透BBB的能力较强，而mAb-ICG的穿透能力较低，ICG几乎不穿透BBB。光热治疗结果表明，团队设计的探针在体外激光激发5分钟后，将温度升高至50°C。最后，光热疗法显著减少了肿瘤体积，并延长了小鼠的生存时间。病理结果证实，探针没有损伤小鼠的重要器官。

FGS可以在机器人辅助手术中实现肿瘤照明。手术机器人具有许多优势，越来越多的研究人员报告了该领域的显著进展。未来，机器人手术将取代人类手术，因为机器人的“手指”具有更高的自由度，使它们能够执行更复杂的操作。机器人“手”提供了更高的稳定性，从而实现了更精确的手术。

然而，自主手术需要使机器人能够独立识别肿瘤的方法。NIR-II FGS导航，可能是使机器人能够自主切除肿瘤的最佳手术方法。在最近的研究中，许多研究团队已经确定了MCT4作为成像靶点的潜力，而另一些人则提出其作为治疗靶点的效用。此外，在最近的研究中，发现了各种MCT4配体，表明MCT4作为癌症治疗中关键靶点的新意义。

总之，团队的研究结果，强调了CCM-mAb-ICG探针对胶质瘤治疗中FGS和治疗干预的潜在疗效。研究结果证明了，这种组合探针穿过血脑屏障靶向肿瘤的卓越能力。需要进一步的研究，来完善这项技术，确认其对其他靶点和癌症类型的效果，并找到解决伦理问题和确保该技术安全性的解决方案。

参考资料：

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The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: a summary.

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2.Abdalla G. Hammam A. Anjari M. D'Arco D.F. Bisdas D.S.

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