西湖大学施红军团队：ENU基因筛查揭示先天性心脏病中关键收缩与神经元基因突变

2024年8月12日，西湖大学医学院施红军团队在期刊《Genome Medicine》上发表了题为“ENU-based dominant genetic screen identifies contractile and neuronal gene mutations in congenital heart disease”的研究论文。研究结果表明，影响发育中心脏早期血流动力学扰动的基因突变，可能作为冠心病的遗传危险因素起着重要作用。

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-024-01372-x#Sec2

研究介绍

 01 

先天性心脏病（congenital heart disease， CHD）是最常见的出生缺陷形式，约1%的活产儿受累。它也是1岁以下儿童的五大死因之一。尽管产前保健有所改善，对危险因素的认识有所提高，但全球冠心病发病率在过去50年中稳步上升。随着内科和外科干预的进步，大多数冠心病患者现在可以存活到成年期，导致1990-2017年老年人群的患病率翻了一番。无法控制冠心病的发病率，凸显了病因学研究的重要性。

目前，大约20-30%的冠心病病例，可以通过基因诊断出已知的冠心病，引起基因改变。这些包括8-10%的总体染色体异常/非整倍体、3-25%的拷贝数变异和3-5%的单基因变异。在综合征病例中，染色体或基因水平更可能实现阳性基因诊断，尽管综合征病例仅占冠心病病例总数的25%。总体而言，8%的病例可归因于新发常染色体显性突变，综合征病例更有可能得到解释（高达28%的综合征性病例与3%的孤立性冠心病病例可解释）；仅与1.8%的病例有关遗传性罕见变异。到目前为止，绝大多数冠心病病例，尤其是散发性孤立病例的病因，仍知之甚少。

尽管在一些家族聚集中已发现经典的孟德尔遗传模式，但孤立性冠心病的总体兄弟姐妹或后代复发风险为2%-6%，这表明大多数冠心病病例是多因素起源的，范围从多种遗传改变到基因-环境相互作用。Gifford等人发现3个基因（MKL2、MYH7和NKX2-5）的杂合突变联合遗传，导致人类和小鼠的左心室致密化（LVNC）。Priest等人发现了蛋白质相互作用网络，特别是一对相互作用的胶原基因（COL2A1、COL9A1），这些基因在AVSD三重奏中富集，为寡源遗传提供了支持。

ENU（N-乙基-N-亚硝基脲）是一种烷基化剂，通常用于诱导小鼠突变，以模仿人类的自发突变。一项基于ENU的小鼠冠心病隐性前向基因筛查研究发现，以前与冠心病无关的Sap130和Pcdha9双重隐性突变，是HLHS的新二基因起源。同一基因筛查还揭示了61个基因的91个隐性冠心病突变，其中一半与纤毛形成有关，其中偏侧性缺损综合征，是最常见的表现。这一发现表明，隐性损伤突变可能是冠心病的一个独特的少数类别的基础，主要是偏侧性缺陷的综合征形式。

由于几乎所有与分离性冠心病相关的已知基因和超过一半的已知与综合征性冠心病相关的基因，都表现出常染色体显性模式，因此，减少剂量或基因表达水平，而不是基因产物完全丢失，更有可能是大多数冠心病病例的机制。单独来看，这些突变可能不会引起冠心病，但它们的联合存在，可导致冠心病的发展。为了鉴定这种导致疾病的杂合突变，团队在小鼠中采用了大规模基于ENU的正向显性筛选，来探索冠心病的潜在新遗传危险因素。这项研究发现，调节早期胚胎心脏收缩力的基因存在大量突变，这是导致冠心病的一种新机制。

研究进展

 02 

在冠心病小鼠中富集的心脏收缩基因

在校正多重检验（FDR<0.05，Storey的q值程序）后，病例和对照组分别有148个和25个基因显著富集。在所有这些病例富集基因中，Notch1、Fbn2、Prrl2和Rere是已建立的CHD基因，在人类中具有常染色体显性遗传模式。已知在对照小鼠中富集的基因，与具有常染色体显性遗传模式的冠心病相关。

参与调节心脏收缩的基因，如钙离子跨膜转运、动作电位和肌肉结构发育，是最丰富的通路之一。例如，Ryr2和Ryr3，它们编码参与兴奋 - 收缩耦合的兰尼定受体；Atp2a2和Atp2b2，它们编码ATP驱动的Ca亚基2+离子泵对心脏舒张至关重要；Cacna1e和Cacna1s，它们编码钙进入所需的钙电压门控通道亚基。编码对调节膜电位至关重要的钾通道亚基的Abcc9和Kcnma1也被富集。

许多参与神经元功能和发育的基因在这些病例中的比例也很高。这些包括参与神经突生长和轴突引导（Slit2、Chl1、Celsr2）、神经元迁移（Wdr47、Kif26a）和神经递质分泌（Stxbp5、Stxbp5l）的基因。相比之下，分析结果没有发现对照组中突变增加的基因的通路，或过程有任何显著富集。这些发现强调了参与心脏收缩力的基因，以及早期心脏功能的潜在神经元调节，在冠心病发展中的重要性。

研究结果证实了异常通道反应、异常心血管形态、肌肉收缩力受损和异常神经反应的显著富集。案例富集基因集与随机10,000个置换数据集（p < 2.2e−16，Hotelling's T平方检验）显著不同。当从最小到最大排序时，病例丰富的基因集的p值，在神经系统表型所有p值的前0.01%内，而心血管系统表型的p值在前0.17%。综上所述，病例富集基因与心脏收缩和神经元功能及发育的关联，是特异性的。

在有心脏缺陷的小鼠中富集的基因的GO术语富集分析。q 值为 0.05 <（Benjamini-Hochberg 方法）的通路，被认为是显著的。

人冠心病中富集的心脏收缩相关基因

团队比较了在病例中被确定为代表过高的373个基因和在对照中代表过高的432个基因的突变耐受性。比较结果显示，与冠心病相关的基因，在功能上对破坏性突变的耐受性较差，表明它们在冠心病发展中的潜在作用。这些病例富集基因的LoF变体的观察/预期分数，在统计学上显著低于对照中富集的基因。因此，在病例富集的基因中，功能丧失不耐受评分（pLI）的概率更高。与对照富集基因相比，该病例中富集的基因的错义变异，也显著耗尽。这些结果表明，与其他基因相比，病例富集基因对损伤突变的耐受性较差，进一步支持了它们在冠心病发病机制中的潜在作用。

对这些基因的富集分析表明，认知和神经发育是富集最多的细胞过程之一，包括参与轴突生长和引导的基因（PLXND1、SEMA3B、SEMA3D、SEMA6A、ULK2）、神经营养因子和对神经元分化至关重要的转录因子（ATOH1、NOTCH1、LHX2、NTF4），以及突触发生和神经传递（SLITRK1 LRTM2、CLSTN2)。参与肌肉收缩和发育的基因，如钙电压门控通道亚基CACNA1S和肌原纤维组装所需的基因（MYH11、TNNT1、NRAP和OBSCN），也在病例中得到富集。对照组未富集与心脏收缩或神经系统发育相关的基因。

人类冠心病的通路和过程富集分析。a 在病例和对照中富集的基因中观察到的/预期（oe）功能丧失变异数的比率。b 病例和对照中富集基因的 pLI 评分。c 在病例和对照中富集的基因中观察到的/预期（oe）错义变异数的比率。d 病例和对照中富集基因的错义Z评分。e 病例中富集基因的途径和过程富集分析。f 对照中富集基因的通路和过程富集分析

研究结论

 03 

在本研究中，小鼠的饱和ENU诱变筛选，导致鉴定出大量以前未知的与冠心病相关的基因。所有这些变异在受影响的动物中都以杂合状态存在，这与寡生遗传模型一致。心脏收缩和神经元基因在冠心病小鼠中富集最为显著。这一发现，与人类病例对照基因负荷试验的后续发现一致。

除了极少数基因（如Notch1）外，通过小鼠筛选和人类冠心病负荷试验鉴定的这些基因中的大多数，传统上并不被认为是基于家族连锁分析的经典单基因冠心病引起基因。当仅删除基因的一个拷贝时，这些基因中的大多数不会引起心脏缺陷或严重影响小鼠的成年心脏功能。根据这些观察结果，在心脏发育的某个阶段，特定收缩相关基因的剂量减少，可能会暂时破坏逐渐成熟的肌细胞成熟和增加的代谢需求之间的平衡，导致心脏功能的暂时中断，如心率、节律或收缩力。这种功能障碍最终可能会在心脏完全成熟后消退。这一理论需要通过敲除单个候选心脏收缩基因的一个拷贝，并研究其对早期心脏功能的影响，及其对冠心病的风险来检验。

小鼠胚胎的解剖学研究表明，表达囊泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT）的副交感神经元和表达酪氨酸羟化酶（TH）的交感神经元，分别存在于静脉极和背侧中胚层。这些位置与发育中的房室结和窦房结紧密对齐。然而，这些早期神经元件的功能尚不确定。 

对这些观察结果的另一种可能的解释是，某些被注释为具有神经传导功能的基因，也可能调节心肌的动作电位。例如，R型钙通道Cacna1e，在心脏和中枢神经系统中都有表达。ATP2A2突变与皮肤病，以及神经精神疾病和心力衰竭有关。这一发现可能解释了为什么从遗传学角度来看，神经发育障碍和心律失常，是影响冠心病幸存者的普遍合并症。

目前尚不确定调节心脏收缩的基因突变，如何导致冠心病的风险。编码心脏离子通道和细胞内钙处理的基因突变，与先天性心律失常综合征有关。虽然心律失常是结构性心脏缺陷患者的常见合并症，但可归因于钙处理基因的冠心病单基因原因，仍未明确。团队假设离子通道和钙处理基因的杂合功能丧失突变，可能会在胎儿心脏发育的某个阶段诱发心律失常。然而，仅靠血流动力学障碍，可能不足以引起形态学畸形，除非它发生在其他易感基因（如Notch1、Klf2和Yap）突变的背景下，这些基因已知参与心内膜对流动剪切应力的反应，并介导心内膜到间充质的转变过程。因此，本研究中确定的候选双基因集的同时半敲除，对于在未来的实验中检验这一假设，是必要的。

参考资料：

1.van der Linde D, Konings EEM, Slager MA, Witsenburg M, Helbing WA, Takkenberg JJM, Roos-Hesselink JW. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis. J Am Coll Cardiol. 2011;58(21):2241–7.

2.Zimmerman MS, Smith AGC, Sable CA, Echko MM, Wilner LB, Olsen HE, Atalay HT, Awasthi A, Bhutta ZA, Boucher JL, et al. Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Child Adolesc Health. 2020;4(3):185–200.