苏佳灿/崔进/刘媛媛/陈晓团队：3D打印皮肤类器官1.0促进全层皮肤缺损愈合｜BAM

近期，上海交通大学医学院附属新华医院、上海大学、海军军医大学第一附属医院苏佳灿教授、刘媛媛教授、陈晓教授、崔进教授等团队在科爱期刊Bioactive Materials上联合发表研究论文：3D打印人源性皮肤类器官促进全层皮肤缺损愈合的研究。本研究成功构建皮肤类器官1.0用于全层皮肤缺损创面的治疗，证实皮肤类器官可以加速创面愈合速率，促进创面再上皮化及血管化，提高创面愈合质量，实现创面原位修复，具有良好治疗效果。
01研究内容简介
大面积全层皮肤缺损是临床常见难题，目前治疗方式均存在明显局限性。现有各种修复材料缺乏能够原位生成真皮、表皮的成分，导致创面瘢痕增生，新生成皮肤纤维化严重，结构及功能同正常皮肤相差较大，对患者生活质量造成严重影响。因此，急需新的治疗方法来解决这一难题。皮肤类器官可以高度模拟皮肤组织结构及功能，是理想的创面修复材料。基于以上研究基础，本研究使用人源性角质形成细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞构建皮肤类器官，同时创造性的采取挤出式3D生物打印及光交联复合工艺打印皮肤类器官并应用于小鼠全层皮肤缺损，证实皮肤类器官可以促进全层皮肤缺损愈合，具有良好的临床应用前景（图1）

图1. 3D打印皮肤类器官构建过程及其促进创面愈合示意图。使用人源性角质形成细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞构建皮肤类器官，同时采取挤出式3D生物打印及光交联复合工艺打印皮肤类器官应用于小鼠全层皮肤缺损创面修复，证实皮肤类器官可以促进创面再上皮化及血管化，实现创面原位修复。 
1皮肤类器官的构建及表征
首先，将人源性角质形成细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞按数量比2：1：1在3D培养下形成细胞球，培养7天后，对其进行表征。免疫荧光染色显示：细胞球外层表达表皮标志物，核心表达真皮及血管标志物。细胞增殖检测显示细胞球具备良好的增殖能力。

图2. 皮肤类器官的构建及表征。A. 显微镜下细胞球1天和5天时的形态。B. 细胞球HE染色。C. 细胞球Ki67染色。 D. 细胞球VIM免疫荧光染色。E. 细胞球K1、K10、K14免疫荧光染色。F. 细胞球CD31免疫荧光染色。
2 水凝胶理化性能及生物相容性研究
对水凝胶的理化性能进行研究，溶胀率及流变性能分析结果显10%GelMA为最适打印浓度。然后对水凝胶生物相容性进行测试，细胞活力及增殖实验结果显示3种皮肤细胞在10%GelMA均具备较强的增殖能力及活力。最后对3D打印可行性进行验证，结果显示打印最佳速率为1.2-1.5mm3/s, 打印时采用双光源交联方式细胞死亡数量更少。

图3 水凝胶的理化性能及生物相容性研究。A. 不同比例GelMA的溶胀特性。B. 剪切率分别为5%、10%、15%时，水凝胶黏度曲线变化规律。C. HaCaT在水凝胶表面的生长状况。D. HSF和HUVEC在水凝胶表面的生长状况。E、F. HSF和HUVEC的CCK-8结果。

图4 不同光照策略下，载细胞球水凝胶样品的生物相容性。A.不同打印速率及挤出速率对打印质量的影响。B. 细胞在单光源及双光源交联时生长情况。C. 水凝胶内细胞的CCK-8染色结果。D. 打印完成后的大体形态。
3创面愈合情况分析
为评估生物3D打印皮肤类器官的治疗效果，在免疫缺陷小鼠背部制造直径为1 cm的全层皮肤缺损创面，并将打印出的皮肤类器官植入创面，结果显示皮肤类器官组创面愈合速率最快，上皮化出现时间最早，创面渗出更少。

图5 皮肤类器官促进免疫缺陷小鼠皮肤缺损愈合疗效观察。A. 皮肤类器官体内治疗效果实验流程图。B. 不同时间各组小鼠创面大体形态。C. 不同时间创面闭合模拟图。D、E. 不同时间创面闭合率及创面大小统计学分析。
4皮肤样本组织病理学染色
为了评估皮肤类器官对创面愈合质量的影响，分别于8天及16天收集小鼠创面皮肤样本进行组织病理学染色。结果显示皮肤类器官可以原位修复皮肤缺损，表皮及真皮贴合更加紧密，胶原排列更为整齐，新生成皮肤更接近正常皮肤。

图6  3D生物打印皮肤类器官通过原位修复提高创面愈合质量。A. 样本染色实验流程图。B. 创面皮肤HE染色。C. 创面皮肤MASSON染色。D. Col-I 及Col-III免疫组化染色。E. hCD31及hVIM免疫组化染色。F、G. Col-I 及Col-III免疫组化半定量分析。
5 创面再上皮化及血管化分析
为检测创面再上皮化及血管化，对创面取材并进行免疫荧光染色，染色结果显示皮肤类器官可以显著加快皮肤缺损创面的再上皮化及血管化进程。

图7 创面在上皮化及血管化检测。A. 实验设计流程图。B、C. hCD31免疫荧光染色及半定量分析。D、E. K14免疫荧光染色及半定量分析。
6 3D生物打印皮肤类器官加速伤口愈合机制探讨
为进一步研究3D生物打印皮肤类器官促进创面愈合的机制，我们在16天时对小鼠创面皮肤取材并进行RNA测序，结果显示3D生物打印皮肤类器通过抑制炎症加速伤口愈合。

图8 3D打印皮肤类器官促进创面愈合机制分析。A、B. 差异表达基因Venn图和火山图。C. 差异表达基因的热图分析。D、E. 差异基因GO富集分析。F、G. 差异基因KEGG富集分析。H. 差异基因GSEA分析。
综上所述，本研究使用人源性角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞成功培养出皮肤类器官，同时将挤压式生物打印及双光源交联技术相结合，将皮肤类器官打印成与创面大小及形状相同的生物符合材料。最后通过动物模型证实皮肤类器官可以加快创面愈合速率，促进创面原位修复，促进上皮化和血管化，提高伤口愈合质量，具有良好的临床转化前景。该项工作以“3-D bioprinted human-derived skin organoids accelerate full-thickness skin defects repair”为题发表在《Bioactive Materials》（中科院1区；IF：18.0）。苏佳灿、崔进、刘媛媛、陈晓为文章共同通讯作者，张涛、盛世豪、蔡伟煌、杨慧健为文章并列第一作者。（转化医学网360zhyx.com）