【Lancet子刊】北京大学人民医院王辉团队：靶向下一代测序在呼吸道感染诊断的临床应用

2024年9月， 北京大学人民医院王辉团队在期刊《eB ioMedicine》上发表了题为“Enhancing lower respiratory tract infection diagnosis: implementation and clinical assessment of multiplex PCR-based and hybrid capture-based targeted next-generation sequencing”的研究论文。研究数据表明，tNGS在下呼吸道感染中具有广谱、快速、准确和成本效益的优势。与mNGS相比，tNGS对吸入性肺炎（mp-tNGS）患者的毛霉菌、非结核分枝杆菌和厌氧菌的敏感性较低，对耶氏肺孢子菌的检测能力强。这项将增强科学界对tNGS的全面理解，包括tNGS的靶点选择、引物或探针设计、实验条件的优化、在前瞻性样本中的性能和临床场景。tNGS未来在感染领域，具有较大的临床应用前景。

https://www.thelancet.com/journals/ebiom/article/PIIS2352-3964(24)00343-8/fulltext

研究背景

 01 

下呼吸道感染（LRTI）是全球发病率和死亡率的主要原因，具有巨大的医疗负担。多种病原体，例如细菌、病毒和真菌，可导致LRTI，临床表现难以区分。快速准确地检测病原体，可导致广谱抗生素减少并促进患者康复。然而，传统的诊断方法在培养困难和周转时间（TAT）方面存在缺点，并且需要事先假设病原体的类型。

随着新一代测序（NGS）技术的发展及其临床应用的增加，NGS已成为诊断遗传病和癌症的重要方法。最近的研究表明，NGS技术在诊断临床相关微生物方面，具有巨大潜力。它可以在一次测试中评估所有微生物，并且响应迅速，因此，其应用范围很广。然而，必须克服一些障碍，例如，高人类宿主核酸背景、定植鉴别和高成本。

在此背景下，广谱靶向NGS（tNGS）已成为mNGS的一种经济高效的替代方案。从技术上讲，tNGS的方法，包括在测序前使用PCR或杂交捕获来富集靶标，自2010年代以来没有显著变化。尽管如此，tNGS的靶标谱已经从单重检测（例如，16SrRNA、18SrRNA、ITS扩增子测序）或低多重检测，扩展到高多重检测。mNGS、单重扩增子测序奠定的基础，以及随后的技术进展，为多重PCR-tNGS（mp-tNGS）和基于杂交捕获的tNGS（hc-tNGS）的兴起奠定了基础，成为测序技术的突出趋势。

一些报道证明了，tNGS的临床应用在不同类型的感染中。mNGS和tNGS用于病原体鉴定及其诊断价值，已在以前的研究中得到证明。然而，它们的临床应用和在不同情况下的适用性差异，仍不清楚。这项研究旨在探讨tNGS在临床实践中，鉴别下呼吸道感染的可行性。

研究进展

 02 

mp-tNGS和hc-tNGS的诊断性能

与培养相比，mp-tNGS和hc-tNGS的敏感性分别为94.7%（95%置信区间[CI]：82.3-99.4%） 和89.5%（95%CI：75.2-97.1%），特异性较低，分别为57.8%（95%CI：50.3-64.9%）和56.0%（95%CI：48.7-63.2%）。与复合参考标准相比，mp-tNGS和hc-tNGS的敏感性分别为86.2%（95%CI：79.0–91.6%） 和82.7%（95%CI：75.2–88.7%），而mp-tNGS（96.8%[95%CI：91.0–99.3%]）和hc-tNGS（91.7% [95%CI：84.2–96.3%]）显示出更高的特异性。对于mNGS，与复合参考标准相比，敏感性和特异性分别为88.4%（95%CI：81.5-93.3%）和90.4%（95%CI：82.6-95.5%）。

在前瞻性研究的251名患者中，91名在CMT中显示出阳性结果。在129例中，通过mp-tNGS或hc-tNGS检测到病原体。与培养相比，mp-tNGS和hc-tNGS的敏感性为96.8%（95%CI：83.3-99.9%）和100.0%（95%CI：88.8-100.0%），特异性为47.2%（mp-tNGS[95%CI：40.4-54.1%]）和46.3%（hc-tNGS[95%CI：39.6-53.2%]）。与复合参考标准相比，mp-tNGS和hc-tNGS的敏感性分别为86.5%（95%CI：80.0-91.4%）和87.3%（95%CI：81.0-92.0%）。此外，mp-tNGS（90.0%[95%CI：81.9–95.3%]）和hc-tNGS（88.0% [95%CI：79.6–93.9%]）的特异性，低于回顾性研究中的特异性。对于mNGS，与复合参考标准相比，敏感性和特异性分别为85.5%（95%CI：79.1-90.6%）和92.1% （95%CI：84.5-96.8%）。前瞻性研究中，两种tNGS方法，具有良好的一致性。

mp-tNGS和hc-tNGS方法的临床诊断效果评估。

mp-tNGS、hc-tNGS与mNGS的临床评价

在这项前瞻性研究中，使用了251个样本，来评估mp-tNGS 、 hc-tNGS和mNGS的临床诊断性能。使用所有3种方法，都检测到了几乎一半的病原体（224/465）。在mp-tNGS和hc-tNGS共同检测到的病原体中，检测到较高比例的RNA病毒，而DNA病毒和细菌在hc-tNGS和mNGS检测到的病原体中，所占比例较高。致病病原体组的标准化读数，高于非致病病原体组。

mNGS对稀有病原体（如米根霉、芽状芽孢杆菌和黑曲霉复合体）表现更好，而tNGS检测到更多的病毒和耶氏肺孢子菌。仅通过mNGS检测到的18种致病病原体，是9种细菌（MTBC、鸟分枝杆菌复合体 [MAC]、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和嗜麦芽葡萄球菌、皮氏不动杆菌）、2种RNA 病毒（SARS-CoV-2和人正红病毒4型）和6种丝状真菌（米曲霉、支链支枝杆菌、黄曲霉复合体、烟曲霉、球形枝孢菌和黑曲霉复合物）和一种酵母（Meyerozyma guilliermondii）。两种tNGS检测到但mNGS漏诊的23种致病病原体，是9种真菌（耶罗维奇疟原虫、烟曲霉和微孢根霉）、3种 DNA病毒（EBV 和 HSV1）、7种RNA 病毒（SARS-CoV-2、鼻病毒和呼吸道合胞病毒B、人冠状病毒OC43、人正红病毒4）和4种细菌（肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和脓肿分枝杆菌复杂）。7种RNA病毒中有5种仍未被mNGS鉴定，可能是由于缺少RNA工作流程，医生没有要求。mNGS检测到的9个缺失真菌中，有7个是P. jirovecii。hc-tNGS和mNGS检测到21种细菌，但mp-tNGS漏诊了21种细菌，因为8个样本中的21种中，有16种是肺脓肿或吸入性肺炎患者的厌氧菌。总体而言，对于mp-tNGS，9%的 DNA 病原体因面板设置而缺失；而对于mNGS，18%的RNA病原体由于未检测到RNA而缺失。

mp-tNGS、hc-tNGS和mNGS的致病病原体检出率，分别为84.3%（95%CI：78.9-88.7%）、89.5%（95%CI：85.0-93.0%）和 88.5%（95%CI：83.8-92.2%）。此外，3种NGS方法的检出率，均显著高于CMTs（P<0.001，卡方检验/Fisher精确检验）。tNGS的病原体谱可以覆盖超过95%（245/251[mp-tNGS]和249/251[hc-tNGS]）的病例。

新型隐球菌Ag的敏感性，显著高于mNGS和tNGS。mNGS和tNGS检测到的MTBC，比Xpert-MTB多。同时，mNGS检测到的非结核分枝杆菌（NTM）比tNGS多。此外，对SARS-CoV-2进行基因分型，并在物种水平检测和鉴定NTM，这表明mp-tNGS可以识别更多病原体负荷低的样本，而hc-tNGS可用于识别更精确的亚型。

前瞻性研究中使用tNGS和mNGS方法检测病原体的性能（n=251）。

研究结论

 03 

团队系统评价了mp-tNGS和hc-tNGS，对BALF样本中病原体检测的疗效。tNGS的病原体谱可以覆盖95%以上的病例。研究结果表明，tNGS由于其成本较低且检测能力好，在大多数情况下，具有较大的临床应用前景。研究数据也有助于更全面地了解tNGS，为tNGS检测的开发、技术参考和临床应用，提供参考和指导。

参考资料：

1.Tsitsiklis, A. ∙ Osborne, C.M. ∙ Kamm, J. ∙ et al.

Lower respiratory tract infections in children requiring mechanical ventilation: a multicentre prospective surveillance study incorporating airway metagenomics

Lancet Microbe. 2022; 3:e284-e293

2.Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory tract infections in 195 countries: a systematic analysis for the global burden of disease study 2015

Lancet Infect Dis. 2017; 17:1133-1161