【Nature子刊】“基因魔剪”再升级！Cas12a敲入小鼠助力疾病建模

2025年3月20日，耶鲁大学/约翰霍普金斯医院的研究团队在期刊《Nature Biomedical Engineering》上发表了题为“Cas12a-knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune-cell engineering”的研究论文。

https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2

在这项研究中，团队描述了一系列以C57BL/6为背景、在Rosa26基因座上插入条件性或组成性表达LbCas12a或高保真增强AsCas12a的基因敲入小鼠。团队还介绍了一种同时进行双基因激活和基因敲除（DAKO）的系统。

Cas12a基因敲入小鼠以及病毒和非病毒载体为基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程的体内外应用，以及复杂基因相互作用的解构提供了一个多功能工具包。

01

研究背景

Cas12a的Lb变体（LbCas12a）可同时或依次扰乱癌细胞系中的多个基因。LbCas12a酶与腺相关病毒（AAV）载体一起被用于将嵌合抗原受体有效敲入人类原代T细胞的基因组位点，同时敲除假定的检查点抑制剂。经证实，AsCas12a的工程化版本enAsCas12a（取代E174R/S542R/K548R）及其高保真版本enAsCas12a-HF1（取代E174R/N282A/S542R/K548R）扩大了PAM序列并提高了多重基因编辑效率。因此，开发具有稳定Cas12a基因敲入的小鼠品系有望实现高效的体内外多重基因组工程，尤其是在小鼠原代细胞中。

02

利用LSL-enAsCas12a-HF1小鼠开发同步DAKO系统

流式细胞术分析表明，sgItgb4-crCD24-Cre DAKO靶向导致CD24 SKO的细胞群蛋白减少量与SKO对照组（crCD24-Cre）相当。与单基因CRISPRa靶向对照相比，sgItgb4-crCD24-Cre DAKO也导致了细胞群体水平的ITGB4蛋白上调。DAKO组ITGB4上调较高可能是由于CD24和ITGB4之间潜在的相互作用。与sgItgb4-Cre和crCD24-Cre对照组的背景水平相比，只有在DAKO组中研究人员观察到了相当高水平的预期双靶向细胞群，其基因调控方向正确。这些结果表明，DAKO系统可以在单细胞水平实现高效、同步的基因激活和敲除，从而在免疫细胞中实现正交双基因靶向。

与LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH双转基因小鼠同时进行DAKO。

03

总结

1. 组成型和条件性Cas12a小鼠菌株可高效实现体内和离体多重基因组工程，适用于多种应用领域；

2. 与Cas9小鼠相比，这些小鼠编辑效率相当，且具有基于crRNA阵列的多重基因编辑独特优势，可促进体内治疗性基因靶向、疾病/肿瘤建模和原代免疫细胞工程的快速无缝工作流程；

3. 研究结果可用于高通量CRISPR筛选研究复杂遗传问题，如免疫细胞中效应子和记忆表型转换，以及不同肿瘤类型或复杂基因型肿瘤模型的本土肿瘤建模；

4. 组成型Cas12a菌株中不同器官Cas12a表达水平不同，混合CRISPR筛选时需考虑目标组织中Cas12a表达水平，建议使用组织/细胞类型特异性Cre驱动因子驱动Cas12a表达；

5. 研究结果有望产生具有其他变体的Cas12a小鼠及不同安全港基因座敲入的小鼠，推动Cas12a基因编辑工具包在不同领域的广泛应用。

参考资料：

1.Wang, J. Y. & Doudna, J. A. CRISPR technology: a decade of genome editing is only the beginning. Science 379, eadd8643 (2023).

2.Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573 (2016).