我国生物制品中残余DNA检测标准与技术

我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA的含量进行限制。酵母、大肠杆菌表达的生物制品限定不超过10ng/剂，CHO和vero细胞表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过100或10pg/剂。2010年版中国药典附录收录了DNA 探针杂交法和荧光染料法作为残余DNA检测方法。以地高辛标记斑点杂交法为代表的DNA杂交法因为操作复杂，耗时较长，且只能半定量，在2014年美国药典修订版征询意见稿中（ PF40(2)）中已经被剔除。以PicoGreen为代表的荧光染料法是基于荧光染料分子直接与双链DNA结合后,经带有荧光检测功能的酶标仪激发后产生荧光信号，因为不能检出单链DNA，且没有序列特异性，以及灵敏度较低（>300pg）等原因，早已被欧美药典摒弃。

我国2010版药典及2015版药典（附录IX B 外源性 DNA 残留量测定法）的征求意见稿中收载了的DNA探针杂交法和荧光染料法，而2009年美国USP就收录了杂交法、阈值法和qPCR法，到2015年底USP将只收录高灵敏度、高特异性的qPCR法作为残留DNA检测的推荐方法。由此可见qPCR法将成为国际公认的残留DNA检测方法，也可能会是我国下一版药典的主要修订内容。国内生物制品研发与生产企业，以及生产纯化填料的上下游企业，尽早建立以qPCR方法为基础的宿主残余DNA检测体系，将有利于改进工艺、提高产品质量，实现与欧美发达国家生物药品标准的接轨。

为了提升国内企业和监管部门对生物制品中宿主残余DNA的检测技术水平，实现与国际标准的接轨，中检院推出了基于qPCR技术的国产CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（国家药品标准物质目录编号410001）。研发过程中除了常规方法学研究和稳定性考察，还开展了DNA碎片化、种属特异性、不同的仪器通用性、抗蛋白干扰、国外同类产品性能对比等研究，并在验证试验中考察了对国内多家生产企业和研发企业不同样本与基质的适用性。采用国家标准物质CHO细胞DNA标定并验证的试剂盒提供了从样品提取、纯化到PCR检测的整套试剂，定量灵敏度达到10fg/rxn，DNA片段大于120bp，内标加样回收率在70~130%（新版美国USP的标准将调整为50~150%），可以为CHO细胞表达的不同品种、不同剂量的生物制剂提供灵活、准确的DNA限量检测。试剂盒具有2年保质期，并由联合研发单位中科院湖州营养中心提供免费技术咨询和操作培训服务，帮助企业尽快掌握该技术。研发单位计划陆续推出E.coli、Yeast和vero细胞残余DNA检测试剂盒，为国内生物制药产业的发展、为监管部门制订国家标准提供技术支持。（转化医学网360zhyx.com）