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腾讯登录Developmental Cell:伯克利大学的科学家通过剪切基因组，构建了Cas9的筛选文库
| 导读 | 来自加州大学伯克利分校的科学家已经开发了一种新的方法，可以有效的构建用于CRISPR研究的引导RNA（gRNAs）的全基因组文库。该文库既可以用于基因编辑的敲除筛选，也可以用于荧光标记的染色体筛选。 |
该研究是由Andrew Lane和Rebecca Heald领导的，科学家们开发了一种从生物体本身的基因组中构建gRNAs的方法，而不是通过合成的方法。“我们推断，任何潜在的DNA序列都能够由酶加工成sgRNAs文库，并且其还可以用于标记染色体区域，”作者在近日发表在《Developmental Cell》上的文章这样写道。
gRNA是能够使CRISPR/Cas9如此灵活且强大的关键技术，其几乎能够靶向基因组的任何一个部分。标准的gRNA可编辑部分是长20个氨基酸，并且其之后必须立即在5’段含有一个NGG组，这个部分被叫做PAM。这些补充部分是单链gRNA的一部分。
为了构建文库，研究人员在大约含有PAM的基因组位点处使用限制性内切酶将其切成20-21个核苷酸片段。然后他们将这些片段转录成gRNA，并将其与含有93个核苷酸的3’gRNA Cas9发夹链接，构成了全长的gRNA。
科学家们将这种方法命名为CRISPR-EATING，后半部分称为“Everything Available Turned into New Guides”。
CRISPR-EATING也有一些局限性。“引导文库的精确成分没有合成的基于寡核苷酸的文库那么精准，这可能导致该文库的引导在基因组中靶向不止一个位点的可能性大大增加，”作者写道。
但是这篇文章证明了用酶的方法可以构建gRNAs的两种应用：荧光标记染色体和全基因组敲除筛选。
为了标记染色体， Lane和他的同事们在实际中并没有使用全基因组。相反，他们使用了计算工具来分析，基因组的哪一个部分可能会产生最有效的引导。
然而，Lane等人在大肠杆菌中使用了全基因组构建了筛选基因敲除的文库。用这种方法构建一个细菌的gRNAs文库的成本不超过100美元，并且Lane表示，CRISPR-EATING相比较于通过合成法构建gRNAs，可以大规模的储存。
gRNA是能够使CRISPR/Cas9如此灵活且强大的关键技术，其几乎能够靶向基因组的任何一个部分。标准的gRNA可编辑部分是长20个氨基酸，并且其之后必须立即在5’段含有一个NGG组，这个部分被叫做PAM。这些补充部分是单链gRNA的一部分。
为了构建文库，研究人员在大约含有PAM的基因组位点处使用限制性内切酶将其切成20-21个核苷酸片段。然后他们将这些片段转录成gRNA，并将其与含有93个核苷酸的3’gRNA Cas9发夹链接，构成了全长的gRNA。
科学家们将这种方法命名为CRISPR-EATING，后半部分称为“Everything Available Turned into New Guides”。
CRISPR-EATING也有一些局限性。“引导文库的精确成分没有合成的基于寡核苷酸的文库那么精准，这可能导致该文库的引导在基因组中靶向不止一个位点的可能性大大增加，”作者写道。
但是这篇文章证明了用酶的方法可以构建gRNAs的两种应用：荧光标记染色体和全基因组敲除筛选。
为了标记染色体， Lane和他的同事们在实际中并没有使用全基因组。相反，他们使用了计算工具来分析，基因组的哪一个部分可能会产生最有效的引导。
然而，Lane等人在大肠杆菌中使用了全基因组构建了筛选基因敲除的文库。用这种方法构建一个细菌的gRNAs文库的成本不超过100美元，并且Lane表示，CRISPR-EATING相比较于通过合成法构建gRNAs，可以大规模的储存。
“我们能够花更少的钱构建文库，这会使得我们能够对一些潜在的生物进行基因筛查，”甚至是那些基因组还没有进行测序的生物。（转化医学网360zhyx.com）
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