Cell子刊：让CRISPR-Cas9基因编辑更廉价的简单技术

  来自加州大学伯克利分校的研究人员发现了一种更廉价及简单的方法，让热门的基因编辑工具CRISPR-Cas9靶向切割或是标记DNA。
  自3年前发明这一技术以来，由于它能够很容易地结合并切割非常特异的DNA序列、失活基因，CRISPR-Cas9如暴风般横扫基因组学领域。这为靶向基因疗法治愈遗传疾病，及发现疾病的病因带来了巨大的希望。
  此外，还可以调整这一技术，借助于一种荧光标记结合及标记DNA，使得研究人员能够定位和追踪正在分裂的活体细胞细胞核中成千上万基因其中的某一基因。
  新开发的技术现在使得构建出让CRISPR-Cas9精确靶向DNA的向导RNA变得更加的容易。确切来说，所需材料的成本不到100美元，任何人都可以生成成千上万、覆盖生物体整个基因组的精确引导探针。
  研究人员在最新一期《发育细胞》（Developmental Cell）杂志上，详细描述了这一称作为CRISPR-EATING的过程。
  在原理论证研究中，研究人员将常见肠道细菌――大肠杆菌的整个基因组变成了覆盖88%细菌基因组的包含4万个向导RNAs的文库。每个向导RNA都是一个长20个RNA碱基对的片段：CRISPR-Cas9利用它作为模板来找出互补DNA结合并进行切割。
  这些文库可用于传统的CRISPR-Cas9编辑中靶向基因组中任何特定的DNA序列并切割它，当研究人员试图阐明某一基因的功能时就会这样做：即敲除这一基因，看看细胞中会发生什么不好的事情。这可以帮助确定疾病的原因。这一称作为遗传筛查的过程要分批来完成：将成千上万的探针各自导入培养板上数十万细胞的单个细胞中。
  论文的第一作者、加州大学伯克利分校博士后研究人员Andrew Lane说：“我们可以花更少的钱来生成这样的向导RNA库，使得有可能可以在较少研究的生物体中进行遗传筛查。”
  实时监测细胞
  但Lane和同事、加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学教授Rebecca Heald开发出这一技术，是为了实时追踪活细胞中尤其是有丝分裂过程中的染色体。这是Heald主持的一个大型研究项目的组成部分，旨在阐明当生物体从几个细胞生长为具有许多细胞时，是什么控制了细胞核和其他亚细胞元件的大小。
  “这一技术将使得我们能够给整条染色体涂上颜色，我们可以实时观测它，在细胞周期过程中在细胞核内追踪它，或当它经历发育转变例如在胚胎中时，看看它的大小和结构如何发生改变，”Heald说。
  这一新技术利用了标准PCR来生成来自研究人员感兴趣的任何DNA片段，甚至来自整个基因组的大量短DNA。随后在称作PAM的区域中精确剪下这些片段――PAM对于CRISPR结合至关重要。再利用限制性内切酶切割离PAM端20个碱基对的片段，就生成了CRISPR利用来在基因组中搜查互补位点的精确大小的向导RNA。这些向导RNAs可以很容易地整合到CRISPR-Cas9复合物中，生成成千上万可标记或切割DNA的探针。
  加州大学伯克利分校创新基因组计划管理和科学主任Jacob Corn 说：“通过利用基因组自身来作为向导RNA的来源，他们的方法使得几乎所有实验室都能构建出靶向连续区域的文库。这对于基因组成像和某些类型的筛查可能非常有用。”
  原文摘要：
  Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening

  CRISPR-based technologies have emerged as powerful tools to alter genomes and mark chromosomal loci, but an inexpensive method for generating large numbers of RNA guides for whole genome screening and labeling is lacking. Using a method that permits library construction from any source of DNA, we generated guide libraries that label repetitive loci or a single chromosomal locus in Xenopus egg extracts and show that a complex library can target the E. coli genome at high frequency.

（转化医学网360zhyx.com）