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腾讯登录革命性基因编辑技术引发投资热点
| 导读 | 基因组编辑技术(Genome Editing)，是一种能够对目的基因组进行定点改造，从而对未知功能基因进行研究和基因治疗的技术。基因编辑技术正在引领投资热潮。 |
基因组编辑技术(Genome Editing)，是一种能够对目的基因组进行定点改造，从而对未知功能基因进行研究和基因治疗的技术。传统的基因组编辑技术有Cre-LoxP、Flp-Frt技术等，优点是重组效率高，缺点是耗时长，需要依赖胚胎干细胞。人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术目前应用最普遍，其优势是摆脱传统技术对于胚胎干细胞的依赖并且使用范围广，在临床应用上有很大的潜力。
人工核酸内切酶介导的基因组编辑三大技术包括：ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas
人工核酸内切酶介导的基因组编辑三大技术包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技术。其中 ZFNs技术整合效率高，可用于治疗艾滋病；TALENs技术构建较为简单，可用于治疗白血病；CRISPR系统最大优势在于能够同时实现多个基因的编辑，并且靶向效率更高。
基因编辑技术应用相关疾病研究取得重大进展
目前，已经有多种模式生物实现了目的基因组DNA的编辑，基因组编辑技术既为这些模式生物中功能基因的研究做出了贡献，也为相关疾病的研究打下了基础。我国科学家丁秋蓉首次证明可以通过体内特异靶向敲除PCSK9基因来防治心血管疾病的新基因治疗方案，被美国心血管学会选为2014年心血管领域十大进展。
未来机遇与挑战并存，前景看好
基因组编辑技术未来的发展趋势有：与干细胞结合构建疾病模型，编辑干细胞基因制备治疗性干细胞，编辑免疫细胞基因制备治疗性免疫细胞，深入解析人类基因组学信息，开发CRISPR基因编辑技术为新的基因治疗方案。该技术也面临障碍，因此寻找高效、特异、安全的体内运输方式，并且同时全面评估CRISPR系统体内编辑的脱靶率和长期安全性将直接决定该技术平台是否能真正用于临床基因治疗。
投资策略与建议
目前国内外涉及基因组编辑技术的公司有Intellia Therapeutics公司、CRISPR Therapeutics公司，Editas公司等。在当前时点，精准医疗板块我们建议关注香雪制药(300147,股吧)，劲嘉股份(002191,股吧)，北陆药业(300016,股吧)，澳洋科技(002172,股吧)，姚记扑克(002605,股吧)，达安基因(002030,股吧)，迪安诊断(300244,股吧)，新开源(300109,股吧)，安科生物(300009,股吧)，荣之联(002642,股吧)，中源协和(600645,股吧)等。
风险提示：研发失败以及政策变化
精准医疗系列研究之一：二代基因测序：下一个百亿美金市场；
精准医疗系列研究之二：基因+大数据的颠覆应用：从癌症基因测序到辅助生殖
注释
ZFNs(Zinc-finger nucleases, ZFNs)：锌指核酸酶技术
TALENs(transcription activator-like effector nucleases,)：类转录激活因子效应物核酸酶技术
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR associated proteins)：成簇规律间隔短回文重复序列系统 技术
DSB(double strand break)：双链断裂结构
NHEJ(non-homologous and joining)：非同源末端连接
HDR(homology-directed repair )：同源重组
RVD(repeatvariant diresidues)：重复可变双氨基酸残基序列
PAM：原型间隔序列毗邻区
正 文
一、人工核酸内切酶介导技术优于传统技术，目前应用最普遍
基因组编辑技术(Genome Editing)，是一种能够对目的基因组进行定点改造的技术。通过对目的基因组的改造，从而达到对未知功能基因进行研究和基因治疗的目的。传统的基因组编辑技术有Cre-LoxP、Flp-Frt技术等，这类技术的优点是重组效率高，缺点是耗时长，需要依赖胚胎干细胞。人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术目前应用最普遍，其优势是摆脱传统技术对于胚胎干细胞的依赖并且使用范围广，因此在临床应用上有很大的潜力。
利用人工内切核酸酶技术进行基因组编辑有两个需要注意的关键环节：
一是利用构建好的人工内切核酸酶与目的DNA片段相结合并且特异性地切割基因组DNA，形成双链断裂结构(doublestrand break, DSB)；
二是利用目的细胞内的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)系统来对形成双链断裂结构进行修复，从而实现对目的基因组的编辑。
关于通过引入移码突变敲除基因的效率，NHEJ过程要比HR过程效率高很多。考虑到细胞进行NHEJ和HR修复DNA是两个相互拮抗的过程，Chen Yu等人通过体外筛选的方法找到一些小分子化合物能调节细胞抑制NHEJ过程增强使用HR过程而实现精确的基因组编辑。
二、人工核酸内切酶介导的基因组编辑三大技术介绍
人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技术。
1、ZFNs技术：整合效率高，但构建难度大、费用高
1985年，Miller等首次在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的转录因子(transcription factor IIIA, TFIIIA)中发现了具有锌指结构的蛋白(Zinc-finger protein, ZFP)。锌指结构是由多个Cys和His残基通过Zn2+螯合而成的蛋白质结构，包括锌指DNA结合域和相应限制性内切酶（如FokI，属于IIS型限制性内切酶）的DNA切割域，能够识别特定的DNA结合位点并对靶DNA进行切割。通常，一个ZFNs能够识别9-18 bp长度的碱基，识别特异性不强，当2个ZFNs分子同时与DNA结合时，其能在2个结合位点的间隔区发生切割作用，从而形成DNA双链断裂区，启动NHEJ或HR修复机制。
ZFNs技术是最早发现的人工内切核酸酶介导的基因组编辑技术。与传统方法相比，ZFNs技术的优点是定点整合效率高，缺点是构建难度大、费用高，这在一定程度上限制了该技术的应用。
在临床测试中已经取得一定成功的例子是利用锌指酶技术敲除艾滋患者血液T细胞或者CD4造血干细胞中的艾滋病毒受体CCR5，从而治疗艾滋病。
2、TALENs技术：构建较为简单，但费用依然偏高
TALENs技术是近年发展起来一种对基因组进行定点编辑的新技术，由于其编辑效率十分高效的特点，2012年Science选为年度十大科学突破。
TALENs核酸酶由两个部分组成：TALE蛋白和核酸内切酶FokI。TALE蛋白家族是一类来源于植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)的分泌蛋白，1989年，Bonas等第一次发现了该蛋白家族的成员AvrBs3。TALE蛋白中的重复可变双氨基酸残基(repeat variant diresidues, RVD)序列决定了TALE蛋白的识别特异性，不同的RVD能够分别对应识别A、T、G、C碱基中的一种或多种。在应用过程中最常见的4种RVD分别为HD(His-Asp)、NG(Asn-Gly)、NI(Asn-Ile)、NN(Asn-Asn)，其中HD识别C，NG识别T，NI识别A，NN识别G或A。与ZFNs技术相似，核酸内切酶FokI只有形成二聚体时才具有酶切活性，当FokI二聚体对DNA双链进行切割时，会引发NHEJ或HR修复机制，利用该机制可以达到基因组编辑的效果。
TALENs技术与ZFNs技术相比，其优势在于TALE蛋白的RVD跟靶序列能够一一对应, RVD与碱基的结合力不受相邻RVD的影响，并且比ZFNs更加容易筛选。
TALENs技术与ZFNs技术相比其优点在于构建更为简单，细胞毒性较低，但构建成本仍然偏高，在应用上也有一定的局限性。
据报道，英国伦敦大奥蒙德街儿童医院免疫学家Waseem Qasim 利用TALENs技术对从健康捐献者血液中分离的T淋巴细胞的基因进行编辑，成功治愈一岁小女孩Layla的白血病。
3、CRISPR/Cas技术：能够同时编辑多个基因，靶向效率高
CRISPR/Cas系统是一种由RNA介导的，可遗传的有效的获得性免疫机制，存在于约40%的细菌和90%的古细菌中，该系统主要是细菌为抵抗噬菌体或质粒所带来外源DNA片段的入侵的免疫系统。
CRISPR重复序列家族的结构通常由一个前导区(Leader)、重复序列区(Repeat) 和间隔区(Spacer)所组成，Leader区是一段长约300~500 bp左右富含AT碱基的DNA序列，其位于CRISPR基因簇上游，该区段序列在同一物种内相对保守，但在不同物种之间差距很大。Repeat区是一段长约24~48 bp的序列相对保守的回文序列，该序列打开后能形成发夹状结构。Repeat区序列并不连续，中间被长度约为26~72 bp的Spacer区所分隔，Spacer区序列与一些噬菌体和质粒的序列存在一定程度的同源性，使该系统能够特异性地识别一些噬菌体和质粒从而抵抗外源基因的侵染。当噬菌体入侵细菌的起始阶段，Cas蛋白复合物与噬菌体中相应的原型间隔序列(proto-spacer)相结合并裂解相关序列，裂解后的proto-spacer序列整合到CRISPR位点的重复序列之间，随即被转录成为crRNA(CRISPR RNA)，并且crRNA的两侧还保留有部分Repeat序列。当宿主再次被噬菌体侵染时，crRNA能够识别噬菌体的proto-spacer序列并将其降解，而CRISPR序列中由于没有原型间隔序列毗邻区(PAM)，因此不会被降解。
根据Cas基因核心序列的不同，CRISPR/Cas系统可以分为3种不同的类型：Ⅰ型(TypeⅠ)、Ⅱ型(Type Ⅱ)和Ⅲ型(Type Ⅲ)。Ⅰ型与Ⅲ型系统的作用机制相类似，Ⅰ型CRISPR/Cas系统以Cas3基因编码的蛋白为核心，Cas3蛋白具有解旋酶和核酸酶的作用，而Ⅲ型CRISPR/Cas系统以Cas6蛋白为核心。在效应阶段，多个Cas基因表达的蛋白形成Cascade复合体，该复合体将前体crRNA加工成成熟的crRNA并与之结合，同时tracrRNA(trans-activating RNA)与crRNA形成双链二级结构，用以招募Cas蛋白。在Cascade、crRNA与Cas所组成的三元复合体的作用下，靶DNA被降解。Ⅱ型CRISPR/Cas系统与Ⅰ型和Ⅲ型系统的不同之处在于，Ⅱ型系统只需要Cas9、crRNA、反式激活crRNA(trans-encoded small RNA, tracrRNA)及RNase III的作用，便可以使靶DNA降解。目前，由于Ⅱ型系统与其余两种系统相比操作更为简便，现在常用的基因组编辑系统为Ⅱ型CRISPR/Cas系统，即CRISPR/Cas9系统。
在CRISPR/Cas9系统中，Cas9基因编码的蛋白具有解旋酶活性，为该系统中的关键蛋白，其主要包含有HNH和RuvC两个活性位点。在反应初始阶段pre-crRNA转录被出来，Cas9蛋白与RNase III对其进行加工形成成熟的crRNA，随后crRNA、Cas9与转录出来的tracrRNA结合形成复合体，该复合体识别并解开与crRNA互补的靶DNA序列，紧接着crRNA与互补的DNA链杂交，随后Cas9蛋白的HNH活性位点开始切割互补的DNA链，RuvC活性位点切割另一条游离的DNA链，从而使dsDNA断裂，从而启动细胞内的HR或NHEJ机制，实现对靶基因组的编辑。在实际应用中发现，为了避免NHEJ的发生，可以将RuvC或HNH活性位点进行突变，突变后的Cas9（Ruv-、HNH-）突变体只有切割单链的活性，从而更容易达到打靶的目的。
由于其能够制造单链切口的特点，使得发生NHEJ的风险大大降低，编辑的效率提高；操作简单，构建成本低，可以希望用于基因治疗；而许多人类复杂疾病也确是由于多个位点的单基因突变组合引发的，CRISPR系统最大优势在于由于其靶位点长度在20 bp左右，因此可以通过将多个sgRNA串联在一起，从而同时实现对多个基因的编辑；基因组编辑技术虽都存在脱靶风险，但相比ZFN和TALEN，CRISPR技术的靶向效率更高，因为其靶向原理是依赖于核酸之间（RNA与DNA）的碱基配对。
II型CRISPR-Cas系统一般构建流程：
（1）设计针对目标基因序列的
（2）构建能表达Cas9蛋白和sgRNA的表达质粒；
（3）转染进入靶细胞；并筛选出转染成功的细胞（可选）
（4）扩增阳性克隆，筛选出CRISPR成功诱导出突变的阳性突变体。
三、基因编辑技术应用相关疾病研究取得重大进展
1、基因组编辑技术应用广泛，助力相关疾病研究
基因组编辑技术作为一种在功能基因组学研究中被广泛应用的方法，因其能够减弱甚至完全阻断目的基因的表达的特点，从而可以通过研究生物体所发生的变化推断该基因的功能。目前，已经在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小鼠等多种模式生物中实现了目的基因组DNA的编辑，基因组编辑技术为这些模式生物中功能基因的研究做出了贡献。
基因组编辑技术也常被用于建立特定基因缺失的动物模型，如人类疾病动物模型等。目前，通过基因组编辑技术建立了多种疾病动物模型，为相关疾病的研究打下了基础。
以及在上文中提到的两例临床成功案例：利用锌指酶技术敲除艾滋患者血液T细胞或者CD4造血干细胞中的艾滋病毒受体CCR5，从而治疗艾滋病，以及英国伦敦大奥蒙德街儿童医院免疫学家Waseem Qasim 利用TALENs技术对从健康捐献者血液中分离的T淋巴细胞的基因进行编辑，成功治愈一岁小女孩Layla的白血病。
2、CRISPR技术尝试用于体内肝脏细胞，用来预防心血管疾病
我国科学家丁秋蓉研究员结合TALENs和CRISPR基因编辑技术，利用病人诱导性多能干细胞，通过精确引入病人基因突变，建立了多种代谢疾病模型用于高通量“个性化”药物筛选。并且其领先将CRISPR技术直接用于体内肝脏细胞基因编辑，首次证明可以通过体内特异靶向敲除PCSK9基因来防治心血管疾病的新基因治疗方案。研究成果在2014年发表在心血管领域权威杂志Circulation Research上，被美国心血管学会选为2014年心血管领域十大进展。
今年在剑桥举行的EmTech会议上，Editas公司CEO Katrine Bosley 表示，该公司计划在2017年开启CRISPR治疗失明的临床试验。如果Editas执行该计划，那么这项研究将是CRISPR编辑人类DNA的首个例子。
四、未来机遇与挑战并存，前景看好
基因组编辑技术未来的发展趋势有：与干细胞结合构建疾病模型，编辑干细胞基因制备治疗性干细胞，编辑免疫细胞基因制备治疗性免疫细胞，深入解析人类基因组学信息，开发CRISPR基因编辑技术为新的基因治疗方案。
但是基因组编辑技术也面临一定的发展障碍，如何进行体内的高效特异安全运输成为CRISPR用于体内基因治疗的一大瓶颈。因此寻找高效、特异、安全的体内运输方式，并且同时全面评估CRISPR系统体内编辑的脱靶率和长期安全性将直接决定该技术平台是否能真正用于临床基因治疗。
五、投资建议
精准医疗从前端的基因测序到后端的免疫细胞治疗以及基因编辑等新技术，当前时点，精准医疗板块我们建议关注香雪制药，劲嘉股份，北陆药业，澳洋科技，姚记扑克，达安基因，迪安诊断，新开源，安科生物，荣之联，中源协和等。
国内外涉及基因组编辑技术的公司有Intellia Therapeutics公司、CRISPR Therapeutics公司，Editas公司等，国内目前设计基因编辑的上市公司主要有劲嘉股份(SZ.002191)和澳洋科技（SZ.002172）。
劲嘉股份是一家商业印刷企业，公司于12月15日与中山大学抗衰老研究中心签署战略合作意向书，双方将在“基因编辑与细胞治疗”等生物技术领域开展合作，协议有效期至2020年末。大健康产业作为公司未来五年发展战略的核心产业之一，本次战略合作将围绕健康衰老、基因编辑、细胞治疗等生物技术等方面开展，是对公司大健康产业初步布局。
澳洋科技2015年11月12日公告声称：公司拟出资人民币2,000万元对吉凯基因进行增资,增资完成后,公司持有其2%股权。吉凯基因提供CRISPR/Cas9慢病毒, 基因编辑大小鼠等技术服务。
六、风险提示
研发失败以及政策变化
（转化医学网360zhyx.com）
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