争议不断的“网红”CRISPR技术研究进展

  CRISPR-Cas9原本是细菌在漫长的进化史中演化出的重要防御机制。规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合，可以在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。 2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。现在CRISPR-Cas9基因组编辑系统的应用延伸到了基因敲除、删除、染色体重排、RNA编辑、全基因组筛选等众多领域。

  CRISPR技术势如破竹，基于这一系统的第三代基因组编辑技术已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造，而且应用也越来越广。在这个百花齐放的春天里，CRISPR也呈现出了一派欣欣向荣之态。
  1. CRISPR新工具助力sgRNA文库设计
  德国癌症研究中心DKFZ的研究团队对此进行了深入研究，成功开发了一个设计自定义sgRNA文库的整合性生物信息学工具，CLD（CRISPR library designer）。这项研究发表在前不久的Genome Biology杂志上。
  据介绍，CLD软件适用于所有基因组已注释的生物，能够有效设计自定义的sgRNA文库，支持经过改良的CRISPR酶，可以靶标基因组的非编码区域。为了证实该软件的实用性，研究人员用CLD设计了针对TRAIL通路的自定义文库，包括12,471个sgRNA。他们在此基础上进行筛选，鉴定了TRAIL通路所有已知的必要元件。（原文：CRISPR library designer (CLD): software for multispecies design of single guide RNA libraries）
  2. Nature重要发现：新型CRISPR样系统
  法国的研究人员报告称发现，巨型拟菌病毒（mimiviruses）利用了与细菌和其他微生物采用的CRISPR系统相似的防御来抵御入侵者。他们说，在拟菌病毒中发现一种起作用的免疫系统支持了他们的观点：这种巨型病毒代表了生命树的一个新分支。（原文：MIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage）
  3. 华人学者齐磊：比CRISPR-Cas9更优的CRISPRi
  Gladstone研究所的华人科学家齐磊（Stanley Qi）在其之前的研究基础上，第一次采用CRISPR-Cas9系统的变种技术，改变了读取诱导多能干细胞(iPSCs)基因组的方式。这是在构建遗传病细胞模型上取得的一个重大技术进步。
  CRISPR——CRISPR干扰（CRISPRi）是建立在这一技术之上，利用了一种特殊失活版本的Cas9蛋白和另一个抑制蛋白KRAB。这些蛋白定位在基因组的靶位点上，无需切割DNA就可以抑制基因表达。
  这项研究在iPSCs、T细胞和用干细胞生成的心脏细胞中均证实了CRISPRi更为强大的能力。例如他们利用基因组编辑来抑制对心脏功能至关重要的一个基因构建出了心脏病模型。（原文：CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs）
  4. Nature子刊：新型CRISPR大片段基因敲入技术
  日本的科学家开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP(two-hit two-oligo with plasmid)）。这两种方法利用了CRISPR-Cas系统和ssODN（单链寡核苷酸）。
  利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200kbp的大片段基因组区域（这是采取传统方法不可能做到的），并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。（原文：ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes）
  5. 上海海洋大学千人计划CRISPR研究成果
  Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线发表了上海海洋大学、密歇根州立大学的一项学术成果，题为“Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system”。这项研究报道了为七鳃鳗基因组而优化的一个CRISPR/Cas系统，并用它来破坏东北七鳃鳗（Lethenteron morii）的基因组位点，效率在84~99%之间不等。（原文：Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system）
  6. CRISPR/Cas9基因组编辑技术在HIV-1感染治疗中的应用进展
  目前，ZFN和TALEN在HIV-1预防与治疗方面虽然存在诸多优势，但是同样存在很多问题，如这两种编辑工具识别靶向位点有限、
  识别模块构建复杂、体外合成费用高以及脱靶几率大等。最近研究发现，成簇的规律性间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9)作为一种新型基因组编辑技术具有制备简单、靶向性强、成本低和脱靶率低等诸多优势，已经被应用于疱疹病毒和乙型肝炎病毒等的临床治疗。作者指出，CRISPR/Cas9基因组编辑技术能够方便、快捷地对目的基因组进行有效编辑。在人类疾病治疗上，CRISPR/Cas9技术的出现为HIV-1、癌症等难以攻克的疾病治疗方面提供了新的医疗手段。
  目前，CRISPR/Cas9对HIV-1的治疗还只限于理论研究层面，并没有真正应用于临床治疗。
  7. CRISPR/Cas9基因组编辑技术在癌症研究中的应用
  CRISPR系统使研究者可以快速简单地对基因组进行精确的编辑，自该方法建立以来被广泛应用于分子生物学研究中。这一技术可以实现DNA的定点突变、基因敲入、Mb级别的片段删除、miRNA及长链非编码RNA的敲除、激活或抑制内源性的基因表达、分子的标记示踪等。由此发展出几种组织特异性编辑的方案，如应用病毒将CRISPR系统导入特定的组织或细胞，或使用特殊的组织特异性启动子等方法，更加适用于疾病机制及治疗的研究。而这些方法可有效应用于癌症相关的分子机制的研究，可以使机制更加的丰满及可信。
  8. Cell重要突破：首次利用CRISPR技术追踪RNA
  基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法，靶向及追踪活细胞中RNA的活动。发布在3月17日《细胞》（Cell）杂志上的这一新方法，有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程，及操控基因转录进行疾病建模。
  论文的资深作者、加州大学圣地亚哥分校的Gene Yeo说：“我们才刚刚开始利用CRISPR技术看到基因组工程改造的影响，但许多的疾病包括癌症和自闭症都与另一种基本生物学分子RNA出现问题有关联。未来这项研究工作的进一步发展可以使研究人员能够检测RNA加工的其他特征，或支持一些治疗方法来纠正致病RNA行为。”（原文：Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9）
  9. 刘明耀、李大力等采用CRISPR纠正血友病突变
  华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀教授和李大力教授课题组在《EMBO Molecular Medicine》上发表文章介绍其最新研究成果，他们用CRISPR-Cas技术介导了一个新凝血因子IX基因突变的体细胞纠正，可改善小鼠的血友病。（原文：CRISPR/Cas9‐mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse）
  10. Nature子刊：用CRISPR对付“癌中之王”
  由于胰腺位置隐蔽，早期胰腺癌很难被发现，多数患者在确诊时已是晚期，5年生存率一般不到5%。这种生长快速而且转移率高的癌症，也被称为“癌中之王”。然而，人们对胰腺癌背后的分子机制还知之甚少。
  转基因小鼠模型是分析基因功能的理想途径，为人们揭示了许多胰腺癌发展的基础信息。不过，建立转基因小鼠模型需要的时间比较长。慕尼黑工业大学的研究团队建立了基于转染的CRISPR/Cas9递送体系，该体系可以对胰腺基因组进行快速有效的多重编辑，以便全面理解胰腺癌的发展机制。这项研究发表在二月二十六日的Nature Communications杂志上。（原文：Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice）（转化医学网360zhyx.com）本文是转化医学网原创内容，转载请点击获取授权