2017，最优质的CRISPR基因编辑技术突破盘点

2003年的一个闷热的下午，正在度假的西班牙微生物学家Francisco Mojica告诉他的妻子，他不打算回家了。多年来， Mojica一直在从事CRISPR研究，引导他进入这个研究领域的是一次偶然的发现：一个神秘的细菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。

这个不归家的下午，后来成就了超过2000篇的文章，其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等顶级期刊的发表的文章。

Mojica博士和同事们偶然发现了一种古老的细菌性免疫防御系统，可以储存病毒的基因密码，如果将该系统比作警察，那它手里就有罪犯——病毒DNA的照片，那么任何之前侵略过该细菌的病毒会被立马清除出去。

这一发现可不可以被用于编辑其他基因呢？可以。

2012年， Emmanuelle Charpentier博士（柏林感染生物学Max普朗克协会的成员）和Jennifer Doudna博士（伯克利大学霍华德休斯医学研究所的教授）的合作，证明了CRISPR系统（使用一种名为Cas9核酸酶）作为一种有效的基因编辑工具，能够定位和切割几乎任何DNA序列。

现在张锋博士和George Church博士如果能够证明CRISPR/Cas9可以编辑人体内的基因，那么生物技术的革命暴风雨，将瞬间席卷全世界。

在过去的6个月中，我们看到了人类胚胎致病基因编辑的重大进展，包括基因编辑工具的拓展：RNA编辑器、CRISPR系统和超精密的基础编辑系统。

那么在2017年，有哪些巅峰的CRISPR编辑系统的进展，值得我们在这一年的年尾反复回味呢？

1.Malorye Allison Branca——CRISPR系统将改变临床的格局

2017年2月份，《Nature》子刊指出CRISPR编辑与测序技术相结合，可以大大提升遗传筛查的效率。

3月份，《Nature》发表斯隆凯特林癌症纪念中心的论文，利用CRISPR编辑构建强效CAR-T细胞研究论文，实现肿瘤的超强杀灭效果。

而如果说起基因编辑技术，就不得不提中国。2016年10月四川大学的Lu You 教授第一个进行了CRISPR实验，他在肺癌患者的肺中注入能够降低PD-1活性的免疫细胞。虽然实验结果有效性被颇多人质疑，但是毫无疑问，这是一项创举。

CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前广泛使用的基因编辑系统。目前来看，CRISPR临床前研究的结果振奋人心，例如血友病、杜氏营养不良症、眼部疾病或是甲状腺素运载蛋白淀粉样变性的治疗。

随着CRISPR基因编辑的技术发展，其应用于临床的前景必将无比宽阔。

2.DeeAnn Visk博士——基因编辑系统的装备库

扩大CRISPR/Cas9的规模需要进行相关的结果验证。最简单的方法就是设计相关的基因库或检测试剂盒，使得CRISPR/Cas9越来越成熟。

Vermeulen博士对CRISPR/Cas9进行多组实验后发现，CRISPR编辑技术可以永久修改基因组DNA而不是暂时改变RNA的表达水平。DNA的合成能力近年来突飞猛进，研究人员能合成更长的DNA并且可以进行质粒的组装，从而简化CRISPR基因库的制备。

ATI可以用来评估CRISPR诱发突变的细胞系。通过使用高活性的T7核酸内切酶及相应仪器可以加快CRISPR的实验进程。长片段的PCR扩增技术已被高度选择性的T7 DNA酶所取代。含有绿色荧光蛋白（GFP）标记的启动子可以解决二倍体细胞系中两个DNA突变鉴别的问题。这种标记可以用来评价细胞中被替换基因的启动子强度。

3.Kate Marusina博士——怀疑论者的“毁灭帝”

在人类的感觉器官中，最容易受损的就是听力，而超过50%是遗传导致的。

为了对此进行研究，科研人员利用斑马鱼进行试验。听力受损的斑马鱼表现出一种特征性的循环游泳行为，以此来与野生型进行区分。研究人员利用基因编辑技术和转录激活因子核酸酶（TALENs），使得隐性纯合子的胚胎表达降低。而这个结果，大大减少了斑马鱼的遗传性听力损失。

4.MaryAnn Labant——基因编辑造福器官移植

利用CRISPR/Cas9技术，人类可以解决跨物种移植这个难题，解决人体组织器官的严重短缺。考虑到伦理和兼容性，器官移植一开始把重点放在猪的器官上。然而， 1997年发生的猪内源性逆转录病毒事件使得全球禁止进行猪器官的移植，人类将所有的希望集中在转基因猪上。随后科学家在PK15猪肾上皮细胞上进行了相关实验根除了猪内源性逆转录病毒。

Milliporesigma公司推出了各种CRISPR产品，为广大科研人员服务。milliporesigma和威康信托基金桑格研究所经过两年的合作，开发出了第一个基因组文库筛选系统，从而减少了实验的时间。

5.MaryAnn Labant——基因编辑路在何方

CRISPR-Cas9基因编辑系统相较于经典的基因治疗所需时间更短，且基因组编辑组件可以被加载到病毒载体中，加速临床开发。早期的基因组编辑使用的是锌指核酸酶的方法（ZFN）。而CRISPR-Cas9的出现为基因编辑注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性，例如靶向性和特异性。CRISPR目前只是用来辅助治疗CAR-T细胞以增强其疗效。

那么现在，CRISPR基因编辑技术可以用来做什么？

基因组CRISPR筛选识别调控蛋白

利用CRISPR进行遗传筛选可以控制相关遗传物质。研究人员构建了由同一启动子表达的绿色荧光蛋白（GFP），然后在其中一组的细胞启动子和GFP之间插入了目标基因调控元件，另一个组则没有。在几个不同的时间点通过对两组细胞进行流式细胞仪分离细胞，检测相应的荧光强度。通过这一实验，我们能够筛选人类蛋白编码基因，并确定负责调控相关蛋白的调节基因。

CRISPR/Cas9能够加快HIV的筛查和治疗

多年来，高通量阵列基因组筛选技术一直是探究生物相关通路的标准，用来研究相应的生物学机制。CRISPR/Cas9的基因敲除技术具有高通量检测的优势，它能转化CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）与CRISPR RNA Cas9蛋白的合成和引物RNA。这项研究的重点是确定艾滋病毒感染的新靶点。通过表型、基因编辑率和基因敲除等方法验证了研究方法的准确性。作者在排除了几个宿主因子的影响后，证实了预期的表型，发现了新的基因靶点。因此，他们展示了利用CRISPR基因敲除筛选方法来确定HIV发病与新感染宿主之间的关系。

克服克隆筛选的瓶颈

CRISPR / CAS系统的瓶颈在于对含有致突变和杂合性的克隆体的测序。虽然可以用筛选方法加以解决，但成本和时间大大增加。目前，科学家们正在转向低成本的筛选方法。AATI已经开发出一个强大的T7核酸内切酶法，能够与片段分析仪无缝集成，用来对CRISPR基因编辑的精度进行测定。

高度特异的基因组编辑：alt-r S.P. HIFI Cas9核酸酶3nls

许多研究者关注的一个问题是CRISPR/Cas9系统潜在的脱靶效应。通过对alt-r CRISPR-Cas9 系统-alt-r化脓性链球菌HIFI Cas9核酸酶3nls进行高效基因组编辑后，其基因编辑效率和精度都大幅提升。IDT的科学家利用Cas9核酸酶使该系统变成更精确的基因组编辑工具。通过对250000多个突变体进行实验后，他们认为这种酶能有效解决脱靶现象的发生。它的优越性能已经得到了许多实验室的验证，这些实验室对各种生物系统进行了相应的转化研究。

1型糖尿病小鼠模型

杰克逊实验室的模型建立服务（MGS）团队已经广泛使用CRISPR技术创造转基因小鼠，他们建立的模型是B淋巴细胞的类开关重组突变体，这在研究1型糖尿病的发展中至关重要。研究人员使用经CRISPR处理过的双阴性Aidca基因小鼠与野生型小鼠进行比较，双阴性Aidca基因小鼠的1型糖尿病发病率更低。结果表明利用CRISPR 技术修改Aidca基因能够显著降低1型糖尿病的发生率。

CRISPR转染技术治疗多个单基因突变的艾滋病的发展

CRISPR是一个突破性的技术，但无论是在基础研究中或作为一种治疗剂，CRISPR基因编辑都必须进入相关的细胞群中才能发挥作用。因此在更为复杂的研究或是临床研究中，CRISPR转染细胞往往比较困难。MaxCyte是基于流式电穿孔技术的基因编辑器，它具有转染效率高和细胞存活率高的特点。

加快分析CRISPR/Cas9产品自动化编辑效率的测量

利用CRISPR/Cas9进行精确的基因修饰需要强大的分析工具来验证目标是否突变成功，并测量实验的效率。传统的CRISPR/Cas9分析的瓶颈是难以处理大剂量的样品。经典分析方法费时费力，不适于高通量分析。PerkinElmer芯片实验室的GX核酸分析仪采用相关的微电流技术，减少了样本测序的数量，大大缩短时间。

代理CRISPR实验

Milliporesigma具有高效的研发CRISPR功能实用性的能力。MilliporeSigma能使不具备DNA切割活性的dspCas9突变并将它放置在CRISPR系统附近，使其产生巨大的DNA切割活性。CRISPR代理实验可以提高三个方面的内容：（1）提高基因组编辑的能力，包括基因敲除和插入；（2）增加靶向性，成倍增加目标基因的靶向性；（3）降低目标基因的切割频率。

在更为自然的生物环境中进行蛋白质生物学研究

标记序列常常被整合到表达蛋白中，从而对蛋白质的功能进行鉴定。然而，许多大尺寸的标记物插入效率低，并且检测通常仅限于抗体层面，导致这些方法使用受限。Promega公司的科学家们通过一种11个氨基酸的肽标签敏感的生物发光检测方法，来克服CRISPR编辑的局限性。

我们已经不再为CRISPR编辑系统的突破感到惊讶，衷心希望这个领域的突破可以尽快推动到临床，帮助人类真正战胜各类遗传病。

参考资料：Supplement: Best of CRISPR 2017

Peak CRISPR: On the Cusp of a Biomedical Revolution

（转化医学网360zhyx.com）