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【Cell】细胞“功能地图”被破解：CRISPR筛选与空间转录组学的革命性突破

首页 » 《转》译 2025-03-17 转化医学网赞(2)

导读	Perturb-FISH推进了细胞内回路的功能基因组学研究，并为细胞间回路的遗传学研究提供了丰富的分子细节。

2025年3月12日，美国麻省理工学院/哈佛大学的研究团队在期刊《Cell》上发表了题为“Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits”的研究论文。

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(25)00061-3

Perturb-FISH推进了细胞内回路的功能基因组学研究，并为细胞间回路的遗传学研究提供了丰富的分子细节。该方法不仅能够揭示细胞内扰动的分子机制，还能解析细胞间相互作用的复杂网络，为理解细胞在组织尺度上的功能提供了新的视角。

研究背景

光学集合筛选将原位gRNA测序与成像分析相结合，为基于测序的集合筛选提供了一种替代方法。将原位基因表达谱的空间转录组测量结合起来，不仅可以探测细胞内和细胞间水平的基因调控回路，还能将这些数据与系统的功能测量配对，如延时记录细胞对给定刺激的反应。虽然这种方法成功地将转录组学、CRISPR干扰和空间信息配对起来，但蛋白质条形码的使用牺牲了集合克隆工作流的优势，Visium的空间分辨率也限制了这种方法在非克隆生长细胞上的应用。因此，科学界仍然需要一种工具，将单细胞空间测量与原位gRNA大规模读取的优势结合起来。

Perturb-FISH恢复组织中基因扰乱的影响：在免疫受损小鼠体内移植的扰乱人类黑色素瘤细胞中探究NF-κB通路

研究人员发现了276种显著的细胞间肿瘤免疫效应，当把数据随机分成两半检查一致性时，这些效应仍然相关。肿瘤细胞中的IRAK1、LBP或TAB2的KOs对T细胞基因表达有强烈的相关影响，它们都下调了TNFRSF9等活化标志物和ZBED2。CD8A和TIGIT受到LBP-KO和TAB2-KO的影响也非常相似。已知CD8A、TIGIT和TNFRSF9在T细胞中共同表达，它们的同时过表达与预后不良有关。相反，这些基因在CHUK KOs肿瘤细胞邻近的T细胞中也有过表达。肿瘤细胞中的MAP2K2-KO也会导致免疫检查点受体配体PDCD1LG2的显著过表达和细胞毒性标志物GNLY的下调。MAP2K2基因突变与黑色素瘤免疫检查点抑制剂治疗失败有关。在IRF7-KO附近，幼稚T细胞标志物CXCR4、CD5和CD28下调，但在IRAK1-KO附近上调。研究表明，IRF7的上调可促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的扩增，而其沉默则会产生相反的效果。IRAK1的高表达与预后不良和免疫疗法获益减少有关，这证实了它们对T细胞的相反影响。

肿瘤异种移植中gRNA干扰结果的一致性，以及不同邻域组成的比较。

总结

1. Perturb-FISH方法的优势：

研究团队开发了一种名为Perturb-FISH的全光学实验方法，能够在单细胞分辨率下研究空间和功能生物学的遗传与分子关联。该方法能够稳健推断细胞内扰动效应，其功效与Perturb-seq相当，但专注于目标基因的表达。Perturb-FISH的关键优势在于能够将遗传扰动的细胞内效应与功能读数（如实时钙成像）相匹配，从而揭示细胞内、细胞间以及功能转录回路的复杂关系。

2. Perturb-FISH在功能基因筛选中的应用：

研究通过筛选星形胶质细胞中的ASD风险基因并记录其对ATP刺激的钙活性，证明了Perturb-FISH的可行性。该方法不仅能够揭示基因对转录组的影响，还能关联基因功能（如钙活性），并识别出可能导致特定表型的靶标。此外，Perturb-FISH还揭示了ASD风险基因的潜在通路，强调了星形胶质细胞在ASD中的可能作用。

3. Perturb-FISH的可扩展性与兼容性：

Perturb-FISH借鉴了MERFISH的向导条形码策略，能够识别多达550个gRNA，具有较高的可扩展性。该方法不仅兼容CRISPR-KO和CRISPRi，还适用于其他基于gRNA的扰动技术（如碱基编辑、CRISPR-a、CRISPR-off和非Cas9系统）。此外，通过在U6启动子中插入T7启动子，可以进一步优化gRNA的读出效率。

4. 细胞间效应的检测与筛选策略：

Perturb-FISH能够检测细胞扰动的细胞外效应，这对于理解细胞间网络和组织功能至关重要。然而，观察邻近细胞的影响需要更高的对照向导比例和细胞密度，以确保特定细胞对的出现率。因此，Perturb-FISH筛选可能需要比传统Perturb-seq更多的对照向导，以提高筛选功率。

参考资料：

1.Chen, S. ∙ Sanjana, N.E. ∙ Zheng, K. ...

Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis

Cell. 2015; 160:1246-1260

2.Kerek, E.M. ∙ Cromwell, C.R. ∙ Hubbard, B.P.

Identification of drug resistance genes using a pooled lentiviral CRISPR/Cas9 screening approach

Methods Mol. Biol. 2021; 2381:227-242