桐树生物报道适合于东亚结直肠癌患者的MSI检测位点新研究

近日，国际肿瘤期刊《Future Oncology》发表的一篇题为“The clinicopathological features and prognosis of tumor MSI in East Asian colorectal cancer patients using NCI panel”文章，通过对东亚结直肠癌（CRC）患者不同MSI检测位点进行对比，确定出最佳MSI检测Panel，并对东亚结直肠癌MSI发生率，临床病理特征及预后的相关性进行分析总结。该研究由上海桐树生物科技及相关2家临床科研机构共同完成，为MSI（微卫星不稳定性）在结直肠癌患者的诊断、临床病理特征及预后意义等方面提供重要的临床指导意义。

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本文研究人员采用两种不同检测位点测定MSI，并结合MMR蛋白免疫组化实验和多元变量分析，探究东亚CRC患者MSI的发生状况及临床病理特征及预后的相关性，研究主要得到以下发现：

●东亚CRC患者MSI发生率略低于欧美人群，人群种族及基因多态性的不同，导致微卫星重复系列存在差异。

●单核苷酸+双核苷酸联合Panel敏感性高于单纯单核苷酸Panel，对于东亚裔CRC患者MSI的检测，单核苷酸+双核苷酸联合Panel更适合。

●东亚裔MSI的临床病理特征与欧美人群基本一致，MSI-H好发于二期，近端、右半结肠部位，且分化较差伴有粘液成分的CRC患者。

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研究背景

结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，据统计，全球每年约有 120 万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过 60 万名患者直接或间接死于结直肠癌。因此，结直肠癌已成为现阶段威胁人类健康的重要疾病之一。近年来，随着分子生物学及相关基因组学的发展，人们发现MSI在CRC的精准诊断和治疗中扮演者极其重要的角色，如对CRC预后进行判断，指导5-氟尿嘧啶、伊立替康等化疗药物的反应，帮助诊断筛选Lynch综合征等，MSI已成为结直肠癌预后和临床辅助治疗过程中一个重要分子标志物。

对于结直肠癌MSI的检测，早在2004年，美国国立癌症研究中心（NCI）颁布了贝塞斯达（Bethesda）标准，该标准在MSI检测位点的选择上规定了两种方式：2个单核苷酸（BAT-25、BAT-26）+3个双核苷酸（D5S346、D2S123、D17S250）联合位点的NCI Panel或者5个单核苷酸（BAT-25、BAT-26、NR21、NR22、NR24）单纯位点的Pentaplex Panel。尽管这两种Panel均能准确的检测MSI，但经比较发现，二者在检测内对照设置、MSI-L精准筛查、MSI判定标准等方面仍存在一定的差异和优劣势。近年来，随着MSI相关研究的不断深入，有研究报道针对东亚裔CRC患者MSI表型检测采用2个单核苷酸+3个双核苷酸的联合Panel可能更为适合，但这种观点需要进一步的研究证实。为此本研究以东亚裔CRC患者为研究对象，采用两种不同的位点对MSI进行检测，并采用MMR蛋白免疫组化对两种方法进行评估，旨在为MSI的检测、临床病理及预后提供一定的理论依据。

研究方法

本研究以245例东亚结直肠癌患者为研究对象，其中直肠癌62例，左半结肠癌107例，右半结肠癌40例，其他类型（包括横结肠癌、横结肠-乙状结肠癌、乙状结肠癌等）36例。

采用PCR和IHC对患者MSI和MMR蛋白进行检测，在PCR检测MSI过程中，位点选择采用NCI Panel 和Pentaplex Panel两种检测方法对患者的MSI进行检测，并用免疫组化实验评估MMR蛋白表达与两种Panel检测MSI间的一致性，同时通过多元变量分析MSI-H与临床病理特征及相关基因突变信息的相关性，以此为CRC临床诊断及预后评价提供更为完善的参考价值。

研究结果

1. MMR蛋白表达与MSI的相关性比较

目前，MMR蛋白的免疫组化分析（IHC）已成为临床上检测MSI的一种常用方法，通过检测MLH1、MSH2、PMS2及 MSH6 4种蛋白表达，当4种蛋白均为阳性时，则判读为MMR-I（MMR蛋白完整），如果其中一个蛋白表达缺失则判读为MMR-D（MMR蛋白缺失）。本研究通过采用IHC对患者4种蛋白检测，发现共有28例患者为MMR-D，这28例患者12例（42.9%）为1个蛋白缺失，16例患者（57.1%）为两个蛋白缺失。

对于MSI表型的检测，我们分别采用NCI Panel和Pentaplex Panel两种方法进行检测。在NCI Panel 检测中我们发现有27例患者（11%）为MSI-H表型，2例患者（0.8%）为MSI-L表型，剩下216例患者（88.2%）为MSS表型；相比对于Pentaplex Panel检测，结果显示23例患者（9.4%）为MSI-H表型，1例患者（0.4%）为MSI-L表型，221例患者（90.2%）为MSS表型。值得注意的是，两种方法均发现BAT-25、BAT-26是所有检测位点中最不稳定的，检测灵敏度均大于75%，如图1。

图1 两种方法检测5个MSI标记位点的灵敏度和特异性

2. 不同方法测定MSI状态的一致性比较

通过比较NCI Panel和Pentaplex Panel两种方法的灵敏度和特异性（见表1），结果发现NCI Panel检测的敏感性高于Pentaplex Panel检测的敏感性，这提示NCI Panel检测可能更适合于东亚裔患者。

表1 微卫星标记在无错配修复蛋白表达检测中的预测值

采用MMR IHC对两种Panel进行评估（见表2，表3），结果发现，与Pentaplex Panel相比，NCI Panel与dMMR的一致性可能更高（Kappa值0.898），这表明NCI Panel检测能更好的反映MMR蛋白表达。

表2 免疫组化检测MMR蛋白表达与NCI Panel检测MSI间的一致性

表3 免疫组化检测MMR蛋白表达与五个单核苷酸重复系列检测MSI间的一致性

3. MSI-H与临床病理特征

对于MSI-H与非MSI-H的患者进行比较，发现MSI-H患者与肿瘤分级、右侧肿瘤位置、粘液组织类型相关，与患者年龄、TNM分期、BRAF突变、淋巴结转移不相关。

4. MMR蛋白表达、MSI状态与结直肠癌预后

本研究对245名患者进行为期24个月的随访，结果发现MSI-H患者相比MSS / MSI-L患者有更长的无病生存期（DFS）（图2），同样，MMR蛋白表达缺失（MMR-D）患者较MMR蛋白表达完整（MMR-I）患者表型有有更长的无病生存期（DFS）。以上结论表明MMR-D和MSI-H是CRC患者的两个独立预后因素。

图2 MSI表型与患者DFS间关系

结论

MSI是CRC诊断和治疗领域中一个非常重要的生物标记物，可准确反映CRC病理学特征，同时对CRC的治疗如5-氟尿嘧啶化疗响应也能提供一定的指导，本研究采用两种不同的方法对MSI进行检测比较，并分析MMR蛋白表达、MSI-H与结直肠癌预后间的关系，得到以下结论：

（1） 本研究采用NCI Panel对东亚CRC患者MSI进行检测，发现MSI-H约占11%，这一比例较欧美CRC患者（MSI-H约8-20%）略低，这可能与独特的临床病例特征，种族差异及基因多态性相关。

（2） 采用NCI Panel 、Pentaplex Panel对MSI进行检测，其中NCI Panel检测分析灵敏度似乎更高，同时与IHC测得的MMR比较，NCI Panel检测的一致性也更好，这可能与两种方法的内对照，cut-off值及MSI发生核苷酸位点相关。

（3） 本研究再次证实MSI对CRC患者的预后有一定的指导意义，尤其是MSI-H患者，其无病生存期（DFS）较MSS/MSI-L患者更长，因此MSI-H是CRC治疗预后的一个有效的标志物。

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