Nature子刊详解：微量测序+低成本高效检测侵袭性肿瘤的新技术

近十年来，随着二代测序(NGS)技术在检测诊断和实验室研究中的广泛应用，文库制备方法不断被优化，单样本测序成本也随之下降。然而，同时对多个样本进行高通量测序的成本依旧较高。尤其在肿瘤检测中，需对同一病人的活体采样进行多区域多位点的并行检测，高成本低效率则成为当前对癌症患者进行测序检测的一大难题。

对此，瑞典卡罗林斯卡研究所 (Karolinska Institutet)的研究人员在国际期刊《Nature Communications》上发表了最新研究成果，他们开发出一种新型的廉价检测肿瘤技术，该技术可以基于微量组织样本进行检测，并且能够识别出具有高度异质性和较强侵袭性的肿瘤样本，这将有助于癌症患者尽早发现肿瘤，并接受积极准备的治疗诊断。

拷贝数改变(Copy number alteration, CNAs)是所有癌细胞的一个共同特征，即基因组中染色体区域或基因拷贝数的改变。在同一肿瘤组织中，不同解剖部位的癌症细胞也可能携带着不同的CNAs。而具有多种CNAs的肿瘤通常具有很强的侵袭性，这也意味着即使经过严格准确的治疗，肿瘤也很容易再复发。因此，针对肿瘤组织中CNAs的数量和类型进行准确评估是至关重要的。

同时，随着二代测序技术(NGS)的不断发展，以及单细胞测序的广泛应用，研究人员开始将高通量测序和肿瘤检测相结合，以期找到一种能够高效检出肿瘤组织的新方法。然而，这项研究存在着两个技术限制，其一， 全基因组扩增需要完整的DNA，但目前活体检测多用的组织主要是福尔马林固定及石蜡包埋的(FFPE)样本，因此得到完整的DNA几乎是不可能的。

其二，全基因组扩增测序的成本非常高，普通病患很难承担的起如此高昂的诊断费用，因此这种技术也就很难应用于常规肿瘤检测中。

为了克服这些限制，卡罗林斯卡研究所的研究人员开发了一种名为CUTseq的新基因组检测方法，它可以评估同一肿瘤组织中多个不同部位的CNAs数量和类型，并且检测样本可以是很小一部分的薄组织切片，成本也比现有技术低得多。

CUTseq技术主要将限制性内切酶与体外转录(IVT)相结合，对纯化后的多个样品直接标记gDNA条形码(Barcode)，以此构建多样本混合的DNA文库，这种对单个混合文库进行扩增测序，有效替代了对多个样本同时进行基因组测序的传统方法，极大地降低了测序成本。同时，这种方法对从未固定和固定样本中提取的DNA都是有效的，甚至可用于检测之前储存的FFPE组织切片样本。

研究人员对CUTseq方法在不同的肿瘤细胞系和FFPE组织切片样本中的敏感性和可重复性都进行了全面评估。结果表明，每个细胞系都表现出一种独特的拷贝数改变(CNAs)模式，与其他细胞系的表达模式完全不同，这说明CUTseq在不同癌症细胞系中的检测具有高度特异性。同时，在五组FFPE肿瘤样本(包括两个结肠腺癌和三个黑色素瘤，每个样本有两组重复样本)中，DNA拷贝数的分布在不同分辨率的重复样本之间都高度相似。其中，被检测出的扩增或删除的基因组片段在相应的重复组样本中具有高度相关性。结果也表明，基因扩增过程中，额外的PCR扩增轮数不会对样本拷贝数产生显著偏差。此外，即使降低Reads数量，重复样本之间的相关性依旧存在，这表明CUTseq即使在相对较低的测序深度中，也能够稳定检测出CNAs的数量和种类。CUTseq还可以在单个FFPE肿瘤切片中，对多区域DNA拷贝数进行分析，并在广谱分辨率分布下有效评估瘤内基因异质性。

CUTseq的原理流程图和可重复性结果分析

由此可见，作为一种稳定高效的新型肿瘤基因检测技术， CUTseq可以混合多个低浓度样本，制备一套相同的CUTseq文库后进行扩增，从而得到基于千碱基分辨率下的可靠的DNA拷贝数量和信息。这种方法对于即使浓度只有120 pg 的 FFPE切片样本也同样适用，这是目前市场上大多数NGS文库制备商业试剂盒也很难达到的。

未来，CUTseq技术将更多造福于需要更积极治疗的高度异质性肿瘤的患者，并在癌症诊断和实验研究中得到广泛应用。此外，CUTseq也可以作为细胞系鉴定的平台，在大型细胞系储存库和生物库中作为监测基因组稳定性的有效应用手段。这项技术还可能被应用于生态学，从而低成本有效地评估生物种群多样性变化等。

总之，这项基于高效微量的基因检测技术将对癌症诊断等多个领域具有划时代意义，保质保量的低价肿瘤检测将不再是梦，而是癌症基因检测的新春天。（转化医学网360zhyx.com）

参考文献：Xiaolu Zhang, Silvano Garnerone, et al. CUTseq is a versatile method for preparing multiplexed DNA sequencing libraries from low-input samples. Nature Communications volume 10, Article number: 4732 (2019)

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