【Nature子刊】升级版！“最小”的CRISPR-Cas3系统 可快速准确删除DNA片段，编辑效率近100%

        该系统称为Cascade–Cas3，由进行性核酸酶Cas3，以及一个基于Type IC Cascade的最小系统组成，用于对细菌的基因组进行编辑。在单一CRISPR RNA的引导下，DNA切割在铜绿假单胞菌中产生了大规模删除（7–424千碱基），效率接近100%。

        这项工作由加州大学旧金山分校（UCSF）的Joseph Bondy-Denomy博士领导，并于10月19日发表于《自然-方法》杂志，题为“A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering”。

        该Cas3系统可用来切碎Cas9片段，删除长段DNA。而且它的精度很高，是少有的高质量大规模编辑工具。Cas3作为这一最小的CRISPR系统的一部分，结合了准确性和可变性，已高效地完成了高达424 kb的基因组删除。

        在该研究中，科学家选择并改良了铜绿假单胞菌所使用的CRISPR-Cas3系统。他们表示，该系统符合“最小”类型IC CRISPR-Cas系统的要求。也就是说，它仅利用三个cas基因（cas5，cas8和cas7）来产生可组成Cas3的crRNA导向的Cascade监视复合物。

        研究人员将该CRISPR-Cas3系统用于基因组编辑，并评估了它在铜绿假单胞菌和其他三种微生物中的功能，即大肠杆菌、丁香假单胞菌和肺炎克雷伯菌。他们测试了三种应用：大毒力区域的一步删除、多重靶向和质粒固化。

        研究人员写道：“由单个CRISPR RNA引导的DNA切割在铜绿假单胞菌中产生了大规模删除（7–424千碱基），效率接近100％，而相比之下，Cas9则只产生了小规模的删除和点突变。Cas3产生了来自编程位点的双向缺失，可将铜绿假单胞菌基因组减少837 kb（13.5％）。在使用Cascade-Cas3进行编辑时，同源定向修复模板可以有效地指定大的缺失边界，但Cas9没有。

        研究人员认为，这种源自铜绿假单胞菌的紧凑型CRISPR-Cas3系统，可作为一种新的工具从细胞基因组中切割出更大的DNA片段，并用于开发新疗法以及研究人类和其他生物的疾病以及正常功能的基因编辑。

        Bondy-Denomy说，其他的CRISPR-Cas3系统已经在人类和其他哺乳动物细胞中工作，对于改良的铜绿假单胞菌系统也应该可以实现。

        众所周知，CRISPR-Cas9集成体可在目标位点快速精确地切除少量DNA。然后可以使用其他方法插入新的DNA。但是，UCSF科学家采用的新型CRISPR-Cas3系统却有所不同。该系统中的关键酶Cas3可快速、准确地去除更长的DNA片段。

        Bondy-Denomy解释说：“ Cas3就像带电动机的Cas9一样，找到特定的DNA靶标后，它就可以在DNA上运行并像吃豆人一样咀嚼它，与Cas9不同的是，当Cas3精确地与其DNA靶结合时，它开始在两个方向上咀嚼双链DNA的一根链，从而暴露出一条单链。”

        在UCSF实验中获得的缺失大小不等，在许多情况下包含多达100个细菌基因。研究人员发现，CRISPR-Cas3机制还可使新DNA序列更容易取代缺失的DNA。

该论文的作者补充说：“ CRISPR-Cas3是用于真核细胞的一种特别有前途的工具，因为它将促进对大部分非编码DNA片段的询问，其中大部分功能未知。此外，最近发现，Cas9产生的'基因敲除'（即，导致插入框外突变的小indels）经常编码可能产生蛋白质产物的假mRNA，因此需要采取全基因去除的方法。”

        根据Bondy-Denomy的说法，没有一种简单可靠的方法可以删除细菌中很大的DNA区域，并用于研究或治疗目的。他建议说：“现在，不需要做100个不同的小DNA缺失。取而代之的是，可以只删除一个，然后看看有什么变化。”

        他表示，由于细菌和其他类型的细胞通常用于生产基于小分子或蛋白质的药物，因此CRISPR-Cas3将使生物技术行业的科学家能够更轻松地从这些细胞中去除潜在的致病性或无用的DNA。大范围的细菌DNA广为人知，其未知的功能在某些情况下对于生存是不必要的。此外，细菌DNA包含从其他来源导入的大片段DNA，这可能导致细菌在人的宿主中引起疾病，或转移细菌的新陈代谢。

        CRISPR-Cas3还可以在工业、农业甚至人类基因治疗应用中将整个基因插入基因组。

        在这项最新的CRISPR-Cas3研究中，通过操纵提供给细菌的DNA序列来修复缺失，研究人员能够精确设置这些大DNA修复的边界，而这是CRISPR-Cas9无法完成的。

        Bondy-Denomy先前发现了反CRISPR策略，噬菌体进化为与细菌抗争，这些策略可能被证明可用于在副作用出现之前阻止用作人类治疗剂的Cas酶驱动的基因编辑反应，或用于利用噬菌体去除有害细菌。他说，那些填满了肠道的东西。除了大肠杆菌和其他几个物种以外，人们对那里通常居住的1000多种细菌物种知之甚少。

        他总结道：“非模型微生物在遗传学世界中已被很大程度上抛在了后面，因此我们非常需要开发研究它们的新工具。”（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

【1】https://www.genengnews.com/news/minimal-crispr-cas3-system-makes-substantial-deletions/

【2】https://www.nature.com/articles/s41592-020-00980-w