湘雅医院：新突破！RNA测序揭示乳腺癌遗传模型，促进乳腺癌疫苗开发

乳腺癌占每年新发癌症病例的12%，已成为成人恶性肿瘤中最常见的癌症。HER2靶向治疗已经显著改善了乳腺癌的治疗。MMTV-neu和MMTV-PyMT小鼠已被广泛研究作为乳腺癌研究的模型。

近日，湘雅医院团队在《Cell Discovery》上发表题为“New mouse genetic model of breast cancer from IKKα defects in dendritic cells revealed by single-cell RNA sequencing”的文章。文章指出，IκB激酶α (IKKα)是经典IKK复合物的两个催化亚基之一，属于NF-κB信号传导的上游，在包括KRAS突变的肺腺癌的发生在内的癌变过程中起着关键作用。IKK复合物的另一个亚基IKKβ缺乏会导致树突状细胞(DC)迁移和免疫耐受受损。有趣的是，我们发现小鼠DC中IKKα的条件敲除(IKKα△Itgax)意外地诱导自发性肿瘤出现在乳腺附近，在老年小鼠(≥20周龄，23/58)中肿瘤发生率约为39.6%，脾脏重量增加，脾肿大频繁。此外，我们发现IKKα在IKKα△Itgax小鼠的骨髓源性DC中确实被敲除，而IKKα水平在其他几个组织中是正常的。然而，这种自发性肿瘤的病理类型和起源尚不清楚，探索乳腺癌免疫微环境的小鼠模型的可靠性也有待检验。 

https://www.nature.com/articles/s41421-023-00553-z

研究背景

 01 

近年来，单细胞RNA测序(scRNA-seq)已被广泛用于恶性细胞和肿瘤类型的来源鉴定。因此，我们应用scRNA-seq系统地鉴定了这种未知的肿瘤类型。我们还从Tabula Muris数据库中下载了11个组织scRNA-seq数据集。然后我们进行了PCA分析，发现正常乳腺组织和肿瘤组织具有相似的基因表达模式和相似的免疫表型，这表明IKKα△Itgax小鼠的肿瘤可能起源于乳腺组织。

为了进一步确定IKKα△Itgax小鼠肿瘤的乳腺样特性，我们通过无监督方法检测了12个细胞簇，每个簇都用已知的标记进行注释以对这些细胞进行分类。UMAP图显示上皮细胞中Erbb2和Vimentin富集。为了确定IKKα△Itgax小鼠肿瘤的驱动基因，我们通过比较不同肿瘤细胞群和正常乳腺细胞群来鉴定差异表达基因(DEGs)。我们发现，与正常乳腺细胞相比，肿瘤上皮细胞中S100a8、Erbb2和Tnfrsf1b富集。为了研究基因标记的功能意义，我们在肿瘤细胞和正常乳腺细胞之间进行了单样本基因集富集分析(ssGSEA)。与正常乳腺组织相比，肿瘤上皮细胞中的靶向Kras和糖酵解信号上调，提示IKKα缺陷诱导的自发性肿瘤可能起源于上皮细胞。

通过scRNA-seq和免疫组化鉴定小鼠肿瘤病理和起源

既往证据表明，通过轨迹分析，上皮细胞具有肿瘤细胞从癌前状态到恶性状态的分化状态和基因表达模式，可用于研究癌变的分子特征。然后我们构建了肿瘤细胞和正常上皮细胞的转录轨迹。肿瘤上皮样本沿正常上皮细胞形成具有5个转录状态(S1 - S5)的分支结构，标志着正常上皮细胞的不同分化状态，而正常上皮细胞大多位于S1 。我们使用大规模拷贝数变异(CNVs)来推断这种肿瘤细胞来源，我们发现肿瘤上皮细胞中存在7q、15q、17q和18q增益作为独特事件。我们还检测了两种常见乳腺癌小鼠模型和我们的自发性肿瘤模型的病理类型，发现自发性肿瘤具有高水平Her2、Gata3和细胞角蛋白的乳腺癌特征。为了进一步研究乳腺癌患者和乳腺癌小鼠模型的免疫表型，我们通过免疫组织化学(IHC)检测IKKα和免疫细胞标志物的表达，发现IKKα主要表达在细胞质中。与MMTV-neu小鼠相比，IKKα△Itgax小鼠和乳腺癌患者的CD8+/CD4+细胞比值较高，而IKKα△Itgax小鼠和乳腺癌患者的CD163+/CD68+细胞比值较低。此外，TCGA数据显示，乳腺癌中IKKα水平与HER2表达相关。综上所述，我们的小鼠模型肿瘤具有乳腺癌的特征，更适合模拟乳腺癌的肿瘤微环境。

为了进一步检查肿瘤微环境中的免疫细胞，特别是DC和T细胞，我们通过DEG分析评估了细胞簇的谱系特异性基因表达特征，发现经典树突状细胞(cDC)样群体增加了Ccr7, Ccl22和Fscn1的表达。编码Relb、Pten、Tcf4和Irf7的基因在肿瘤DC中下调，表明与正常乳腺DC相比，肿瘤DC损害了DC的发展。我们还发现，与正常乳腺DC相比，肿瘤DC中的抗原加工和递呈以及T细胞激活信号被下调。与正常乳腺组织相比，肿瘤T细胞中Tcf4的表达降低。与正常乳腺T细胞相比，来自肿瘤的T细胞凋亡信号上调，而激活的T细胞增殖和适应性免疫应答信号在肿瘤T细胞中下调，表明DC中IKKα缺乏损害了T细胞的活化。我们还使用Monocle从正常乳腺组织和肿瘤样本中以伪时间方式订购T细胞并生成轨迹图。来自肿瘤的T细胞位于前分支，并分叉成两个不同的分支。大多数正常乳腺T细胞存在于不同的分支S3。这些数据进一步表明，DC中IKKα的缺失诱导T细胞功能障碍，从而促进肿瘤免疫逃避。

研究结果

 02 

为了进一步确定树突状细胞和T细胞相互作用(CCI)，我们计算了CCI分数，该分数代表了所有配体-受体对中所有亚簇对之间的通信概率。与肿瘤样本相比，正常乳腺样本中CCI更强，乳腺DC中Ccl、Cd86、Faslg和Ifn的表达也强烈上调。在与T细胞外向或传入相互作用的DC中也观察到类似的模式。我们还用流式细胞术研究了不同年龄的IKKα△Itgax小鼠的单核细胞、粒细胞和自然杀伤细胞。与野生型(WT)小鼠相比，老年IKKα△Itgax小鼠(20周龄)血液和脾脏中单核细胞的百分比均降低，肺部中单核细胞的百分比也显著降低。我们还发现，与WT小鼠相比，年轻和年老的IKKα△Itgax小鼠外周血和肺部的粒细胞比例显著增加。此外，老年小鼠DC中IKKα缺乏使外周血和肺中的自然杀伤细胞减少。然而，IKKα△Itgax小鼠脾脏中自然杀伤细胞的数量与WT小鼠相比无显著差异。这些数据表明，DC中IKKα的缺失会影响细胞群，

为了深入了解IKKα△Itgax肿瘤和MMTV-neu肿瘤(GEO: GSE122336)之间的肿瘤浸润免疫细胞，我们从scRNA-seq数据中对CD45+细胞进行了分类，获得了6个簇。虽然这两组具有相似的免疫特征，但在IKKα△Itgax肿瘤中观察到巨噬细胞数量减少，T细胞浸润增加。此外，Pd1和Ctla-4在IKKα△Itgax肿瘤浸润的T细胞中表达上调。UMAP图发现DC特征的Ccr7, Ccl22和Cd68强烈表达。单片伪时间分析显示，MMTV-neu小鼠的T细胞处于细胞晚期状态，而IKKα△Itgax小鼠的巨噬细胞则处于原始细胞分化状态。这些结果进一步证实，与MMTV-neu小鼠相比，IKKα△Itgax肿瘤浸润T细胞和巨噬细胞处于原代细胞状态，这可能有助于肿瘤免疫逃逸。

据我们所知，这是第一个显示免疫细胞遗传缺陷诱发实体瘤的病例。我们认为，确定DC的基因突变是否在表观遗传学上调控乳腺上皮细胞并最终导致上皮癌变是值得的。新的发现可能带来新的肿瘤预防和治疗策略。进一步的研究需要明确这种新型乳腺癌模型的分子机制，以及特定的肿瘤微环境特征，并确定其在IKKα△Itgax小鼠中乳腺细胞增生的特定时间和对HER2靶向治疗的敏感性。我们也相信我们的研究将为探索乳腺癌的免疫治疗提供一种新的小鼠模型，并通过促进DC中IKKα信号传导促进乳腺癌疫苗的开发。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41421-023-00553-z

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。