【Nature子刊】中山大学肖海鹏团队新发现：神经递质降钙素或成为抑制甲状腺髓样癌的关键！

2024年7月19日，中山大学附属第一医院内分泌科肖海鹏团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“The neurotransmitter calcitonin gene-related peptide shapes an immunosuppressive microenvironment in medullary thyroid cancer”的研究论文。本研究提供了对MTC免疫抑制微环境的见解，并提出CGRP受体，可以作为潜在的治疗靶点。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49824-7#Sec10

研究背景

 01 

神经免疫学是一个新兴领域，它连接了两个主要系统，即神经系统和免疫。神经免疫学的最新进展，揭示了神经递质在癌症进展中的肿瘤促进功能。例如，黑色素瘤中的伤害感受器神经元，通过释放降钙素基因相关肽（CGRP），促进肿瘤浸润性T细胞的耗竭。

神经内分泌肿瘤（NET）可能是研究神经递质在人类肿瘤中潜在作用的合适模型。神经内分泌瘤是常见于肺、胃肠道和甲状腺的上皮性恶性肿瘤，可分泌各种类型的激素和神经递质，如胰岛素、5-羟色胺、降钙素和CGRP4。甲状腺髓样癌（MTC）是一种起源于甲状腺滤泡旁细胞的神经内分泌瘤。与最常见的甲状腺状癌（PTC）不同，其5年生存率超过90%。美国甲状腺协会建议，使用多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）凡德他尼和卡博替尼治疗晚期MTC。然而，TKI治疗伴随着显著的高不良反应发生率（38.9-72%），以及对长期治疗的耐药性这一常见问题，需要长期随访和更深入的机制研究。因此，研究MTC的新治疗靶点至关重要。

CGRP是降钙素的转录剪接产物，已在MTC的肿瘤和外周血清中发现。然而，人们对CGRP如何影响MTC微环境知之甚少。Pozdeyev在2020年发表的一项使用mIHC的研究表明，MTC中49%的原发性病变，表现出免疫浸润（大部分分散或聚集在肿瘤周围，14.6%的病例在肿瘤内观察到）。

在本研究中，团队对7名MTC患者和8名PTC患者的肿瘤、邻近正常甲状腺组织和外周血单核细胞（PBMC），进行了单细胞RNA测序分析，报告了单细胞分辨率下MTC的免疫抑制微环境。恶性细胞分泌CGRP可以通过阻碍负调节因子克虏伯样因子2（KLF2）的下调，来破坏瘤内树突状细胞（DC）的发育。目前的研究，提供了对MTC免疫抑制微环境的见解，以及神经递质CGRP对肿瘤影响的人类证据，提出了CGRP受体作为MTC的有前途的治疗靶点。

研究进展

 02 

人类甲状腺癌单细胞景观显示，

MTC中的免疫浸润率低

为了生成人类甲状腺癌肿瘤微环境的全面转录谱，团队对肿瘤组织进行了单细胞RNA测序，并配对了15名初治患者的正常甲状腺组织，包括7名MTC和8名PTC。团队对来自肿瘤和邻近正常组织的228,400个细胞，进行了无监督聚类和均匀流形近似和投影（UMAP）分析。使用每个簇的特征基因，包括众所周知的注释标记，团队鉴定了主要细胞类型，包括T细胞、B细胞、血浆、髓样细胞、增殖细胞、滤泡上皮细胞、滤泡旁细胞、成纤维细胞和内皮细胞。团队还分析了从10份外周血样本中分离的细胞。

甲状腺分化评分（TDS）计算，验证了PTC肿瘤细胞的分化程度低于正常滤泡上皮细胞，表明肿瘤细胞在肿瘤发生中经历了去分化。

根据PTC和MTC之间主要细胞类型的富集比分析，团队发现，包括T细胞、B细胞、血浆和髓样细胞在内的所有免疫细胞均优先分布于PTC，基底细胞在MTC中表现出相对富集。转录组学分析还表明，与队列或癌症基因组图谱计划 （TCGA） 队列的PTC相比，MTC的免疫浸润评分显著降低，表明免疫细胞分布较少。使用免疫组化（IHC）染色，与PTC相比，在MTC肿瘤区域发现的CD45细胞更少。与肿瘤相比，来自PTC或MTC患者的外周血样本具有相似的免疫细胞组成，这表明在肿瘤中观察到的不同微环境，不归因于全身免疫疾病。单细胞图谱表明，MTC可以被识别为一种免疫“冷”肿瘤。

人类甲状腺癌单细胞景观显示MTC的免疫浸润率低。

受CGRP影响的功能失调的DC，

负责诱导MTC中CD8 T细胞的抑制特性

团队进行了涉及CGRP和CD8T细胞的体外实验，以探讨MTC微环境中CD8 T细胞的特性，是否直接受到CGRP的影响。结果显示，长期暴露于CGRP，不影响T细胞增殖或其功能分子的表达。

巨噬细胞也是一个重要的髓系细胞群，具有除DC以外的抗原呈递和免疫调节作用。CCL18巨噬细胞可能是一种具有一定免疫抑制功能的亚型，因为它们的免疫抑制相关基因得分在3种亚型中最高。所有3种亚型的巨噬细胞，在PTC肿瘤中都相对更丰富。MTC中巨噬细胞的M1和M2评分均略低于PTC。两种类型的肿瘤之间巨噬细胞缺乏显著差异，这表明巨噬细胞可能不是原代细胞群，导致MTC和PTC的免疫反应显著不同。

DC是唯一在细胞比例、抗原呈递和共刺激功能方面，与CD8 T细胞活化水平呈正相关的细胞群。功能失调的DC，可能是T细胞反应减弱的原因。CGRP在肿瘤中的表达水平，与免疫微环境中DCs的免疫浸润评分、细胞毒性评分、CD8 T细胞耗竭评分和共刺激功能评分呈负相关。综上所述，团队揭示了受CGRP影响的功能失调的DC，在塑造MTC免疫抑制微环境中的关键作用。

受CGRP影响的功能失调的DC负责诱导MTC中CD8 T细胞的抑制特性。

研究结论

 03 

在本研究中，团队绘制了MTC的综合单细胞景观，揭示了免疫抑制微环境。此外，团队证明了CGRP可以破坏肿瘤内DC的发育，并报告了CGRP在DC发育过程中，阻止负调节因子KLF2下调的机制。

在本研究中，团队展示了MTC的全面单细胞景观，与PTC以及其他一些常见癌症和已知的“免疫感冒”癌症相比，MTC中的免疫浸润较低，这与之前MTC IHC研究中，淋巴细胞数量的减少一致。众所周知，根据免疫细胞浸润的模式，肿瘤的免疫微环境，可以表征为发炎（高免疫浸润）、寒冷（低免疫浸润）和排除（免疫浸润仅位于肿瘤边缘）表型。MTC肿瘤中所有类型的免疫细胞均减少，但与邻近的正常组织相比，仍观察到增加。这表明MTC是一种“免疫冷”肿瘤，而不是抑制免疫细胞功能和通过外周基质细胞迁移的“免疫排斥”肿瘤。

为了研究CGRP在免疫调节中的作用，团队进行了细胞间通讯分析和多免疫组织化学染色，发现肿瘤产生的CGRP，通过CGRP受体CALCRL影响DC。团队发现，来自MTC的DC中cAMP通路的激活水平较高，并通过无监督重聚对DC进行进一步研究，揭示了MTC中DC的功能失调和耐受状态，其特征是与PTC相比，抗原呈递和共刺激功能降低。MTC中DCs的发展，与PTC中DCs的发展有很大不同，表明CGRP可能驱动DCs的异常发展。使用CellOracle进一步分析，揭示了关键转录因子KLF2在DCs异常发育轨迹中的变化。KLF2表达随着DC的正常发育过程逐渐降低，正如在PTC中观察到的那样。相比之下，MTC中KLF2表达水平的下降速度要慢得多。在从单核细胞到DCs的分化过程中，KLF2迅速下调，而CGRP的存在减缓了KLF2的丢失，并最终破坏了感受态DCs的发育。当团队使用cAMP抑制剂SQ22536抑制下游cAMP通路激活时，CGRP影响的KLF2表达降低，抑制的DC功能恢复。

团队的研究结果为MTC提供了转化相关性，因为它将支持RET激酶抑制剂与RET突变MTC免疫检查点抑制剂联合试验的基本原理。另一方面，值得注意的是，团队还发现，CGRP受体拮抗剂Rimegepant可以阻断CGRP的作用，并恢复功能性DC。Rimegepant是美国食品和药物管理局（FDA）批准的用于预防和治疗偏头痛症状的药物。在临床实践中，它被认为耐受性良好且安全。除MTC外，据报道CGRP在其他类型的神经内分泌癌（如小细胞肺癌、嗜铬细胞瘤和神经内分泌前列腺癌）中也有表达。因此，了解CGRP是否也调节这些肿瘤的微环境，将是很有趣的。

总之，团队生成了全面的MTC单细胞图谱，证明了神经递质CGRP在塑造免疫抑制性肿瘤微环境中的关键作用。值得注意的是，CGRP通过激活cAMP通路和防止转录因子KLF2的丢失，来驱动肿瘤内DC的异常发展。这些结果可能有助于开发有效的MTC疗法，并为CGRP在神经系统外的功能，提供人类证据。

参考资料：

1.Schiller, M., Ben-Shaanan, T. L. & Rolls, A. Neuronal regulation of immunity: why, how and where? Nat. Rev. Immunol. 21, 20–36 (2021).

2.Balood, M. et al. Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance. Nature 611, 405–412 (2022).