Nature重磅！CRISPR再迎技术革新！xCas9可有效提高CRISPR效用！

哈佛大学的化学生物学家David Liu领导的研究团队设计出一种称为xCas9新酶，可更多更有效地修改基因组中的位点，进而提高CRISPR-Cas9的效用，同时还可降低脱靶风险。这项研究结果以《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》为题发表在2月28日的《Nature》上。

CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对能力，另一部分是Cas9蛋白对靶DNA的3'末端发现的被称为protospacer adjacent motif（PAM）的DNA序列上的识别能力。

PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。

病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。

随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。不同的Cas9的识别能力不同。

目前，最常用的实验Cas9是从化脓性链球菌中分离而来，称为spCas9，其在具有32亿个碱基对的人基因组中，大约仅能正确识别其中的1/16序列。这就是CRISPR-Cas9技术的真正局限性。

Liu及其研究团队对spCas9稍加改动，迫使spCas9在实验室中迅速扩增，积累突变，再识别各种PAM序列并对临近的DNA进行切割。他们最终获得了xCas9，其可更广泛地识别不同的PAM，从而使得Cas9的识别能力增加了至少4倍。

研究人员对该酶进行了测试，并将其与碱基编辑器组合，他们发现，改变后的xCas9的不仅提高了CRISPR-Cas9的效用，而且切割能力未受影响，甚至降低了脱靶风险，成功实现了双赢。

连续进化的Cas9具有更宽的PAM兼容性

演变后的xCas9在人细胞中的转录激活和基因组DNA切割 

另一方面，加利福尼亚大学圣地亚哥分校的生物工程师Prashant Mali说，同样的方法可以用来改变Cas9酶的其他变体，包括一些有希望用于基因治疗的相对较小的Cas9蛋白质。他说，那些蛋白质往往具有更为严格的限制性PAM序列，若能成功应用这项技术，对基因治疗将是莫大福音！

加利福尼亚斯坦福大学的合成生物学家 Stanley Qi 称这项工作“令人眼花缭乱”，并表示他的团队渴望在实验中应用此项成果。xCas9具有更广泛的PAM识别和更高的特异性，这足够令科学家们兴奋，但是，在彻底挖掘出这项技术的潜力前，仍需要进行更多的测试。（转化医学网360zhyx.com） 

参考文献：

1.Powerful enzyme could make CRISPR gene-editing more versatile

2.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity