国产新技术终于来啦!基因魔剪成了分子诊断的新帮手

“分子诊断”听起来非常“高大上”，其实大家早已不陌生：

要献血？血站采血之后要检测乙肝（HBV）、丙肝（HCV）和艾滋病（HIV）等病毒。

要生娃？抽点血来产前筛查（地中海贫血、血友病、耳聋基因检测等）和新生儿筛查。

想看有没有患癌风险？来做个肿瘤早期筛查吧，看你是不是有肿瘤易感基因。

……

这一切都离不开分子诊断技术。

核酸分子，是一切生命形式最基本的遗传物质。分子诊断技术通过对核酸分子的快速准确鉴定，能够提供各类疾病的患病风险、病因和基因型等信息，从而为疾病的预防、监控和治疗提供相应依据。

目前最为成熟、应用最为广泛的分子诊断技术是聚合酶链式反应技术(PCR技术)。但是，由于该技术操作复杂、仪器昂贵、还涉及多重变温过程，使得该技术在现场和家庭检测领域的应用中受到了极大限制。

中国科学院深圳先进技术研究院副研究员周文华博士等利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，高效启动针对靶核酸分子的指数倍扩增（简称CRISDA技术），可在1小时左右将极低浓度的特征性靶核酸复制至足够被检测到的浓度，而且无需经过任何变温过程。相关研究成果已发表在国际权威刊物《自然·通讯》 （Nature Communications）上，文章共同第一作者为周文华副研究员和胡丽研究助理，通讯作者是喻学锋研究员 (Nat.Commun. 2018, 9, 5012)。相关技术也已申请专利保护。

研究成果以长文形式发表于国际权威刊物《自然·通讯》杂志

PCR：循环变温是我的短板

PCR技术是一种在体外扩增DNA分子的技术，通过在待扩增的DNA片段两侧设计两条寡核苷酸引物，经过多重循环后，实现靶DNA分子的指数倍扩增。

PCR过程示意图

然而，由于PCR的每个循环过程包括了高温变性、低温退火和中温延伸三个温度不同的事件，对仪器的精确控温要求极高。市面上的PCR热循环仪价格普遍在数万至数十万元之间，若想要在家庭、社区或基层检测机构中实现普遍性使用仍是一大难题。

为了克服PCR技术的缺点，一类不依赖变温的检测技术，即等温扩增技术得到了广泛关注。这些技术由于反应温度单一，不受热循环仪的制约，正逐渐在特定领域取代PCR。但是当前，等温扩增技术在体系复杂程度、灵敏度、特异性和抗干扰能力等方面仍存在着缺陷。更重要的是，目前所有成熟的等温扩增检测技术的核心专利均掌握在国外公司手中。

因此，开发出一种性能优异、具有完全自主知识产权的核酸等温扩增检测新技术，对满足我国分子诊断领域日益增长的需求、提高相关产业的国际竞争力意义重大。

基因魔剪变身“搜索引擎+双链开关”

大名鼎鼎的CRISPR/Cas9系统被称为“基因魔剪”，在基因调控和基因编辑等领域应用广泛，该系统的效应蛋白（Cas9蛋白）能够识别特定基因序列，并对识别靶点附近的 DNA 双链进行剪切。

CRISPR/Cas9技术机理示意图。一段与靶核酸序列互补的sgRNA（引导RNA）分子与CRISPR的效应蛋白Cas9形成Cas9-sgRNA复合体后，可在复杂条件下自主寻找靶核酸分子，并一步完成特异性结合与切割。（图片来源：研究团队）

早在2015年初，当世界上绝大多数课题组都将精力和资源投入到CRISPR基因治疗领域时，该团队就率先意识到CRISPR体系在分子诊断领域将有巨大的应用前景和优势：该技术操作简便、灵敏度高、抗干扰性强。“可以说，当时我们是在世界范围内最早提出这一设想的课题组之一。”周文华说。

经过三年不断的努力，第一代CRISDA技术已逐渐成熟。

在CRISDA反应中，Cas9蛋白就像一个具有主动搜寻功能的"开关",在找到具有某一疾病或某一特征相关的特定靶DNA序列后，能高效起始该靶核酸的指数倍“复制”过程。整个反应过程可在从室温到45度的条件下高效进行，对温度要求极低。

实验过程中，Cas9-sgRNA复合体在复杂溶液条件下主动搜寻靶核酸分子并与之结合切割，切割后的靶DNA分子被解旋并暴露出单链区域，扩增引物进一步与该区域结合形成后续扩增反应的“开关”结构。这一结构在扩增酶类的作用下，起始靶核酸分子的指数倍链取代扩增反应。

CRISDA技术作用机理简图。（图片来源：研究团队）

“在实际应用领域，对特定序列的核酸进行检测的难度在于如何对极低浓度的靶核酸分子进行特异性高效扩增。而对特异性扩增后的产物的检测，目前市场已有多种成熟的手段，并不是技术难点。”周文华介绍说。

然而，课题组将CRISPR体系作为核酸等温扩增反应的开关，并应用于分子诊断领域的研究尚属首次。同时，CRISDA技术背后原理十分复杂，为了实现这一基因快检技术，团队在研发过程中也经历了多重考验。“可以说我们当时是在一个完全未知的领域探索，每个技术细节都是靠我们不断的尝试和优化来实现的。” 周文华提到。

CRISDA：四大优势

目前，研究团队已通过两步反应，在90分钟内，对极微量（20 μL）复杂溶液样品中的个位拷贝数的靶核酸分子成功实现了等温扩增检测，如人基因组片段、乳腺癌致病风险相关的突变位点或转基因大豆基因组等。CRISDA技术在这一极微量体积和极低浓度下的优异性能，可完全满足目前分子诊断中，针对循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环游离胎儿DNA（cffDNA）等检测的需求。

利用CRISDA技术对aM量级的靶分子进行单核苷酸多态性（SNP）扩增检测。（a）不同细胞株基因组中rs3803662位点的测序验证；（b）利用CRISDA技术对该SNP位点进行高灵敏度扩增检测。（图片来源：论文）

CRISDA技术在诸多方面均优于传统PCR技术，

首先，在灵敏度方面，由于CRISDA技术与传统PCR技术相比具有更优异的抗干扰性，其可在复杂背景条件下，对aM（10^-18M）浓度的靶核酸分子进行高效扩增检测。而在相同条件下，PCR技术由于抗干扰能力较差，无法实现有效扩增。

其次，在特异性方面，CRISDA技术无需优化即可实现对极低浓度的靶核酸分子进行单核苷酸多态性（SNP）检测。而PCR技术要实现SNP检测则需通过联合测序、酶反应或者多重引物等条件来实现，其成本和复杂程度无法满足快速分子诊断的需求。

第三，在普适性方面，在CRISDA检测反应中，所需的扩增引物设计简单，无需优化即可迅速实现对新位点的检测反应体系开发。而PCR反应或其他等温扩增反应则需经过大量优化。目前，课题组已利用该技术成功检测出人基因组中乳腺癌相关的单核苷酸位点突变，并在野生型大豆中成功检测出万分之三的转基因大豆。

第四，在操作难度方面，CRISDA技术无需依赖仪器，仅通过简单操作，即可在90分钟内即可完成从富集到扩增检测的全部过程。且整个过程对温度依赖极低。而传统的PCR技术则需依赖多步繁琐操作，过程耗时4小时，且对仪器控温要求极高。

传统PCR技术与CRISDA检测技术对比（图片来源：研究团队）

此外， CRISDA技术可与一步法CRISPR靶向核酸富集技术完美结合，在进一步提升CRISDA检测性能的基础上，解决了核酸提取这一困扰分子诊断领域的技术痛点。例如，利用该一步法CRISPR靶向核酸富集技术，可实现对复杂样品中的靶核酸分子特异性提取，可极大地缩短血筛检测样品前处理的难度和复杂程度。同时，这一技术也为未来CRISDA技术在基层和家庭推广奠定了基础。

未来：在家就能做诊断……

近期，周文华等提出的以该技术为背景的“基于CRISPR-Cas系统的核酸高敏快速等温检测技术”项目在中科院首届“率先杯”未来技术创新大赛中，从近千个项目中脱颖而出，获得最终决赛优胜奖。“你们的技术想法非常独到，很好地利用了CRISPR技术的特点，并展现了该技术相比于传统PCR技术的优势。我相信这一技术未来在核酸分子检测领域将有着非常重要的意义。”大赛评委点评中提到。

目前，团队也正在积极和分子诊断行业的龙头企业开展深入合作，将该技术应用于突发或新型传染病的检测，如新型流感，非洲猪瘟等。

未来，团队计划基于CRISDA技术，开发出名片大小的一次性微流控生物芯片，服务于遗传病筛查、流行病诊断、食品安全和公共安全等领域，充分满足从现场检测到家庭检测的市场需求。

“我们设想未来仅需极少量的生物样本，利用CRISDA的生物芯片就能在家零门槛检测老人或儿童患的是普通感冒还是新型病毒性流感。”周文华畅想道，“同时，CRISDA家庭检测仪所获得的结果将实时上传到家庭所注册的社康中心，家庭医生将结合检测结果和最近从社区到地区的流行病风险变化迅速给出最有效的治疗方案。我们希望这一切都能在家庭完成，从而提高患者的诊疗效率，避免到医院就诊过程中的交叉感染，并减少三甲医院的压力，充分发挥基层社康中心的分级能力。”

CRISDA检测系统原理（图片来源：研究团队）

该团队的研究展示了基于CRISPR-Cas9的核酸等温检测技术在医疗诊断和食品安全领域巨大的应用前景，同时也为其他具有类似特性的系统或蛋白在应用上提供了新思路和方法。这一系列研究将有可能推动分子诊断技术和产品从目前的专业机构延伸至基层乃至家庭。（转化医学网360zhyx.com）