权威期刊发表原创结果！桐树生物研发团队成功开发基于qPCR的多基因检测新方法，助力临床肿瘤高效检测

近日，在国际期刊《Small》发表的一篇题为“Developing a New qPCR-Based system for Screening Mutation”的文章中，研究者们基于qPCR的原理，通过革新引物与探针的设计，创新出了一种全新的(Mutation-Selected Amplification Specific System, MASS-PCR)方法，并与ARMS-PCR方法进行了一致性比较，证实了这种新的MASS-PCR方法在临床肺癌驱动基因检测中的有效性。该研究由上海桐树生物与同济大学附属肺科医院共同完成，这一成果为临床肿瘤样本驱动基因热点突变的检测提供了一种新的更加快速便捷、客观可靠的检测方法。

驱动基因的检测对决定肺癌治疗方案十分重要。

目前临床上常用的技术平台包括Sanger测序技术、高通量测序技术（NGS）以及基于qPCR的检测技术，这些不同的技术在敏感性、特异性和应用上各有优缺点。

Sanger测序被认为是检测癌症基因突变的“金标准”，具有高度的分析准确性，但其检测效率低、灵敏度低、检测突变类型有限，且成本较高，对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查较难完成。

NGS是在 Sanger测序之后的一次革命性进步, 采用平行测序的理念, 能够同时对上百万乃至数十亿个DNA分子进行测序, 实现了大规模、 高通量测序的目标。NGS的高通量、高灵敏度、低成本以及可检测未知突变的特点，使其逐渐成为临床实践中不可或缺的测序工具。然而，由于自动化检测平台本身意味着一定的误差率(0.1~15%)，且读长相对较短，因此检测结果的特异性有时有待商榷。

而基于qPCR的检测方法则更加灵敏便捷。例如，ARMS-PCR大大提高了检测灵敏度，使其在肿瘤驱动基因检测方面得到广泛应用。

同样是基于qPCR，上海桐树生物携手同济大学附属肺科医院研究创新出一种全新的MASS-PCR法。该方法是基于突变特异性扩增系统（Mutation-selected Amplification Specific System, MASS）和qPCR技术实现样本DNA中基因突变的检测。依据引物和探针与突变位点的完全配对，抑制野生型模板的扩增，利用FAM荧光从而实现基因突变的实时检测。

MASS-PCR可以直接客观地评价检测结果，从而降低人为主观判读结果带来的假阳性和假阴性风险。

图1. MASS-PCR的扩增曲线

为了验证MASS-PCR方法的可靠性，研究者们进行了临床样本的检测分析。

在2017-2018年间连续收集上海市肺科医院手术切除的肺癌肿瘤组织标本及相应的患者信息，共收集了717名肿瘤患者的组织标本。将其中631例样本同时进行MASS-PCR与ARMS-PCR检测并对检测结果的一致性进行统计学比较，余86例样本进行了MASS-PCR与NGS的一致性比较。为了分析ARMS-PCR、NGS和MASS-PCR的检测结果，研究者又将所有717例样品用“金标准”Sanger测序进行再次检测。

图2. 研究路线图

研究结果如下：

1、 MASS-PCR VS ARMS-PCR

631例样本中，MASS-PCR和ARMS-PCR检出EGFR突变的样本数分别为196例和206例，一致性检验的Kappa值为0.955，P<0.001。在KRAS突变、BRAF突变、ALK融合及ROS1融合的检测，MASS-PCR与ARMS-PCR也取得很好的一致性。因此，MASS-PCR用于肿瘤基因检测是切实可行的。

图3. MASS-PCR与ARMS-PCR突变检测结果的比较

（kappa>0说明有意义，kappa愈大，说明一致性愈好，kappa≥0.75说明已经取得相当满意的一致程度）。

那么，对不一致的结果进行分析时，研究发现差异主要来源于ARMS-PCR和Sanger。在MASS-PCR与ARMS-PCR不一致的样本中，MASS-PCR的结果与Sanger测序的结果更接近。

图4. MASS-PCR与ARMS-PCR结果不一致的样本与Sanger结果的对比分析

2、 MASS-PCR VS NGS

第二组的86例样本中进行了MASS-PCR 和NGS检测，NGS的平均测序深度达15000X。最终NGS检测出81例EGFR突变（94.2%），而MASS-PCR检出了72例EGFR突变（83.7%）。MASS-PCR与NGS的一致性检验Kappa值为0.79，P<0.001，也取得了很好的一致性。

值得注意的是，在11例NGS检出基因突变而MASS-PCR未检出的样本中，9例的MASS-PCR结果与Sanger测序一致。此外，NGS检出了两例EGFR双位点突变，分别是L858R/T790M和19del/T790M，而MASS-PCR只检出了L858R/T790M一例双突变。用Sanger测序验证发现，NGS检测结果为19del/T790M的样本在MASS-PCR和Sanger均只检出19del突变。可见，MASS-PCR法不仅可行，还具有令人惊喜的高特异度。

图5. MASS-PCR与NGS结果不一致的样本与Sanger结果的对比分析

总之，该分析证实了MASS-PCR在临床肺癌驱动基因检测中的有效性，从而让一种新的更加快速便捷、客观可靠的检测方法应运而生。

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