表观遗传学研究利器——ATAC-seq技术，高效探索染色质开放区

1. ATAC-seq可以得到实验时点全基因组染色质开放信息，RNA-seq可以得到同一时点的基因表达信息，将两个组学数据联合分析，可以获得该时点下影响基因表达的的上游调控区域，寻找到影响基因表达的潜在TF（Transcription Factor）。
2. 通过对比不同细胞或者相同细胞在不同阶段的组学数据，可以对比出基因表达调控的差异。
3. 通过CUT&Tag对TF进行验证，找到与TF结合的靶基因。
4. 基因敲除/过表达关键TF，调控目的基因，并结合表型变化，解析转录因子动态调控变化机制。

ATAC-seq技术

染色质可及性（Chromatin Accessibility）：在真核生物细胞中，DNA与组蛋白结合形成核小体，核小体再进一步折叠压缩形成染色质。DNA复制或转录时，染色质紧密结构被打开，称为开放染色质（Open Chromatin）；未开放区域为封闭染色质（Closed Chromatin）。同时，开放区允许反式作用因子与启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件相结合。这种允许调控因子结合的特性称为染色质的可接近性。

表观遗传研究首先要获取染色质开放区信息，以下为常用的4种染色质开放区研究实验技术 ：

图1. 染色质开放区4种研究方法的比较（Epigenetics ＆ chromatin, 2014, 7(1): 33.）。

在ATAC-seq技术诞生之前，FAIRE、MNase、DNasse等研究染色质开放区的方法都有明显的不足，包括涉及多个实验流程，操作复杂，需要大量的细胞，实验周期长且重复性差等。为了解决这些问题，2013年，美国斯坦福大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的方法，利用Tn5转座酶结合高通量测序技术，来研究染色质可及性，即ATAC-seq。
ATAC-seq技术工作原理：ATAC-seq技术的核心是孵育连接测序接头的Tn5酶。在进行ATAC-seq实验时，首先提取细胞核，然后孵育连有接头的Tn5酶。随后Tn5酶对染色质开放区进行打断，在打断的同时加上测序接头，接着进行DNA提取，PCR扩增构建文库。经过测序分析，推断染色质可行性、转录因子结合位点、组蛋白修饰区域和核小体位置。

图2. ATAC-seq技术工作原理图（2013，William J）。

ATAC-seq建库实验流程

一般而言，ATAC-seq文库构建的实验流程包括以下几个部分：

1. 细胞核制备
裂解细胞，制取细胞核。常用的基础细胞裂解液，适用于人源、鼠源的细胞系。对于其他细胞系的裂解，可以在基础细胞裂解液中添加相应的成分。
2. 片段化
打断基因组，获取目的片段。此模块需包含一个孵育测序接头的转座酶，近岸蛋白质可提供特殊优化的转座体（货号：N248），经过ATAC-seq实验证实，可以实现500-50000个细胞建库，核小体分布清晰、信噪比高、特异性强。

图3. 特殊优化的转座体在ATAC-seq实验中的应用

3. DNA提取
片段化之后，可以选择性的进行DNA提取。近岸蛋白质提供小片段DNA提取磁珠（货号：N245），该磁珠能够完整的保留40-100bp的小片段。

4. 扩增
PCR将index连到目标片段上，完成文库构建。
5. 文库纯化
构建好的文库需要纯化后方可用于后续测序。

ATAC-seq技术的应用

ATAC-seq技术比较成熟，天然的优势使其得到广泛的应用。自2013年以来，PubMed上与ATAC-seq直接关联文章搜索达4800余篇，其中不乏Nature、Science等顶级期刊杂志。现在就ATAC-seq的优势，简单了解一下它的应用。
1. ATAC-seq技术对低至500个细胞的实验有效
相对于ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq等染色质开放区信息的探索技术，ATAC-seq技术的优势在于所需细胞量较低，而且信噪比高、特异性强、耗时短（约3h）。

图4. ATAC-seq与DNase-seq、MNase-seq的性能对比（2013，William J）

2. 物种适用性好
ATAC-seq技术经过后续的不断优化，已经满足动物、植物、人等样本的要求，具有很好的物种适应性。

图5. ATAC-seq技术在拟南芥（Robert J. Schmitz）（图5左）、人体T细胞（Howard Y Chang）（图5中）、 小鼠细胞（ Longqi Liu）（图5右）中的应用。

3. 可以用于单细胞测序
单细胞测序技术是近几年研究的热点，通过对单个细胞的测序能够将表观遗传学研究个体化。常见的ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq等技术无法进行单细胞测序，而ATAC-seq经过实验验证，表明其能够进行单细胞测序。