【Small Methods】第一次！华中科技大学郭安源教授团队鉴定单个细胞外囊泡中的RNA特征

近年来，虽已有多项研究证实RNA是EVs参与调控多种生理和病理过程的关键功能分子，在生物标志物方面也有着巨大的临床应用潜力。但已知的EVs相关RNA研究，全部都是将大量EVs作为一个整体进行分析。因而目前缺乏在单EV水平分析单个EV所携带RNA的高通量分析方法，同时对单个EV中RNA的种类、数量和异质性等尚不清楚。

9月6日，发表在《Small Methods》杂志上的题为“Transcriptomic Features in a Single Extracellular Vesicle via Single-Cell RNA Sequencing”的研究论文，揭示了首次利用通过改进的实验和分析方法，基于10x Genomics平台在单EV水平研究EVs的转录组特征。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202200881

研究概述

虽然许多研究已经研究了细胞外囊泡（EV）中的功能分子，但单个EV中核糖核酸分子的确切数量尚不清楚。因此，在单 EV 水平上探索转录组学特征和异质性至关重要。在研究中，基于10x Genomics基因组学平台，从来自人类K562和间充质干细胞的单个EV中分析RNA载体。关键步骤是使用calcein-AM标记完整的EV，通过流式细胞术检测EV浓度，并使用具有自适应阈值的CB2算法来有效区分真实的EV和背景。单EV中的基因数从6到148不等，平均值为52。核糖体基因、线粒体基因和真核翻译伸长因子 1 α 在所有 EV 样品中均具有较高的 EV 百分比。血红蛋白基因在K562-EV中具有独特的高表达，细胞骨架基因在MSC-EV中富集。每个单EV数据集中具有不同标记基因的十个或更多簇显示出EV异质性。此外，整合EV及其亲本细胞揭示了每个集群中的EV和细胞，表明各种EV的不同细胞起源。本研究提供了单EV水平的第一个高通量转录组，并提高了对EV的理解。

研究进展

首先，该研究提出了一种基于10x Genomics 平台的针对EV的高通量测序方法，在单EV水平对EVs转录组特征进行探究。通过使用Calcein-AM染料标记K562细胞和间充质干细胞来源的完整EVs，然后通过流式细胞术检测EVs样本的浓度。分离的EVs使用10x Genomics 平台进行单EVs测序。在数据分析过程中，研究人员经过多次尝试和改进，才发现使用自适应阈值的CB2算法能有效地从背景中区分出真实的EVs。使用可靠的质控参数去除低质量数据，并使用DoubletFinder软件去除潜在的doublets。最终，在三个不同的EV样本分别获得了2088, 3935和1603个EV的转录组数据。

接下来，研究人员对EV转录组进行分析，单个EV中平均含有的mRNA基因数为52，不同EV从6到148个不等。较高比例的EVs中含有核糖体基因、线粒体基因和EEF1A1基因。K562细胞来源的EVs中含有很高的血红蛋白基因而间充质干细胞来源的EVs富有细胞骨架相关基因。此外，通过数据降维和聚类分析，研究人员还证实了即使同种细胞来源的EVs仍具有高度的异质性，也可以划分为多个具有特异基因的不同EVs亚群。

最后，这项研究首次通过高通量的方法在单EV水平揭示EVs的转录组特征和异质性，刷新了人们对单个EV中RNA内容物的认识，为EV的功能研究和改造应用提供了重要基础。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

http://life.hust.edu.cn/info/1277/14115.htm

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202200881

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。