【Nature子刊】超越金标准PCR测试! CRISPR-Cas13实现便捷、高灵敏核酸检测

9月22日，莱斯大学（Rice University）与康涅狄格大学（the University of Connecticut）的高雪课题组、张毅课题组和高阳课题组合作在Nature Chemical Biology杂志发表了题为“Engineered LwaCas13a with enhanced collateral activity for nucleic acid detection”的研究论文。

通过结构导向的蛋白质改造工程，研究团队对LwaCas13a进行了工程化改造、筛选和验证，研发出了具有高旁切活性的Cas13蛋白变体。在生物电子传感器技术的辅助下，此RNA编辑CRISPR-Cas13系统能够对热灭活新冠病毒及临床样本进行快捷、高灵敏度检测。

对于快速检测突发传染性病原体、RNA病毒变种而言，此研究成果具有重大意义。

https://www.nature.com/articles/s41589-022-01135-y

Cas13蛋白

如同它更为知名的“表亲”Cas9一样，Cas13属于细菌天然防御入侵噬菌体系统的一部分。自被发现以来，CRISPR-Cas9已被用于编辑活体DNA基因组，并且在疾病治疗、治愈方面显示出巨大的希望。因其特有的旁切活性（characteristic collateral activity），Cas13（CRISPR-associated protein 13）已被迅速地开发、应用于基于核酸的诊断。

然而，虽然目标核酸预扩增可以为基于CRISPR的核酸检测提供高浓度样品，但繁琐的核酸纯化和等温扩增过程将引发样本污染、RNA降解、非特异扩增等风险。若不使用目标基因预扩增，那么检测灵敏度将会极大地降低。因此，目前人们面临着这样一个课题：如何增强Cas13蛋白的旁切活性，以提高其核酸检测的灵敏度，进而在生物学、临床及环境检测等场景实现快速、实时的核酸检测。

研究团队选取了不同拓扑结构的7个RNA结合域（RNA binding domain, RBD），并将这七个RBDs分别连接到LwaCas13a蛋白的N端或C端，期望通过增强RNA结合能力提高Cas13的旁切活性。结果发现，在所得到的14个融合蛋白中，观察到有两个融合蛋白能有限的提高旁切活性——当找到靶标时，蛋白质会发出荧光，揭示病毒的存在。

该研究的作者之一、来自康涅狄格大学的Yang Song教授表示：“我们可以观测到，相较于野生型Cas13，工程化的Cas13的旁切活性增加了五到六倍。虽然这个数值看起来很小，但对于蛋白质工程而言，着实是十分惊人的一个进展。”

莱斯大学博士后研究员Jie Yang领导了此项研究。

 图片来源：Jeff Fitlow /莱斯大学

更高的旁切活性和稳定性

此外，研究团队用融合蛋白对不同目标RNA进行检测，发现RBD#3L和RBD#4L可从含有生物液体（Biofluid，如病毒运输培养基、唾液、血液、尿液等）的添加样本中检测到新冠、寨卡、登革、埃博拉等病毒，以及微小RNA等生物标记物。与野生型LwaCas13a相比，这些更接近于临床样本的检测中，两个工程改造的融合蛋白具有更高的旁切活性和稳定性。

本文的通讯作者、莱斯大学化学与生物分子系教授Xue Gao表示：“我们希望将此技术应用于例如家庭COVID-19抗体测试；当然，新技术的灵敏度和准确性都将变得更高。我们希望此技术将使测试更加便捷，并且更加经济实惠。”

“不同的病毒有着不同的序列，” Yang Song教授表示，“我们可以设计引导RNA来靶向一个特定的序列，然后即可进行检测——这就是CRISPR-Cas13系统的强大之处。除了SARS-CoV-2病毒之外，此技术还将适用于检测其他各种突变及不同冠状病毒。”

综上所述，RNA编辑CRISPR-Cas13系统不依赖于核酸提取和靶标扩增，并且显示出更高的活性和稳定性，可实现高灵敏、便捷的核酸检测；可广泛应用于各种医学、生物、环境样本的现场检测，有着十分广阔的应用前景。（转化医学网360zhyx.com）

通过使用结构引导的Cas13，莱斯大学和康涅狄格大学的研究人员修改了一种基因编辑工具，以作为SARS-CoV-2病毒存在的高灵敏度诊断测试。他们使用现成的电化学传感器来提供结果。

图片来源：Jie Yang/莱斯大学

参考资料：

https://phys.org/news/2022-09-rna-editing-tool-fast-sensitive-covid-.html

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。